Analisis filogenetik Hyposidra talaca nucleopolyhedrovirus (HytaNPV) yang diisolasi dari perkebunan teh Gunung Mas, Bogor, Jawa Barat dan virulensinya terhadap Hyposidra talaca Walker

Abstract

Hyposidra talaca (Walker) is an important pest of tea plant. H. talaca can cause losses of between 40–100% in the dry season if proper control is not carried out. H. talaca has natural enemies such as predators, parasitoids, and pathogens. One of the entomopathogens is NPV. This study aims to obtain molecular characteristics through DNA polymerase sequences and determine the virulence level of NPV isolates from H. talaca. The same species from different locations can have genetic variability. Therefore, molecular characterization by polymerase chain reaction (PCR) on DNA polymerase sequences is one way to study the genetics of HytaNPV. NPV was isolated from infected H. talaca larvae collected from the field. The DNA isolates were used as templates for PCR for DNA polymerase gene amplification with an amplicon target of ±1,000 bp. A sequencing process followed the PCR provides nucleotide sequence. HytaNPV DNA polymerase sequencing results were aligned with GenBank's BLAST data to provide information on the relationship of HytaNPV to NPVs isolated from other regions. Based on molecular character analysis using DNA polymerase gene sequence, HytaNPV Bogor has a homology level of 93.9% with HytaNPV isolated from India. HytaNPV Bogor has a genetic relationship with the NPV that infects Buzura suppressaria from China and Australia. HytaNPV Bogor is similar to the NPV that infects H. talaca from India. The bioassay of HytaNPV isolate against H. talaca showed the highest LT₅₀ value of 1.92 days was found in concentration of 1.58 x 107 POBs/ml in second instar larvae.

PENDAHULUAN

Baculovirus adalah patogen serangga yang menginfeksi berbagai spesies arthropoda, baik darat maupun air. Patogen ini dapat menginfeksi dengan cepat hingga menyebabkan kematian pada inangnya. Baculovirus pertama kali ditemukan menyerang ulat sutera (Bombyx mori (Linnaeus)) di China (Xu et al., 2013). Entomovirus ini merupakan virus yang paling potensial untuk digunakan sebagai agens pengendali hayati hama serangga pada tanaman budi daya. Famili Baculoviridae memiliki dua anggota genera utama yang dibedakan berdasarkan bentuk badan oklusinya, yaitu Nucleopolyhedrovirus (NPV) dengan struktur oklusi polihedron/polihedral yang mengandung banyak virion dan granulosis virus (GV) dengan struktur yang lebih kecil disebut granula yang mengandung hanya satu virion (Williams et al., 2023).

Nucleopolyhedrovirus (NPV) adalah virus dari keluarga Baculoviridae dan patogen serangga yang efektif sebagai agens pengendalian hama serangga. (Federici, 1997) menyatakan bahwa metode kerja NPV terbilang cepat; dalam 4–7 hari dapat menurunkan populasi larva serangga target lebih dari 90%. NPV juga telah teruji efektif mengendalikan ulat Hyposidra talaca (Walker) dan disebut juga HytaNPV, dengan persentase penurunan populasi hama 50–100% dalam waktu 7–11 hari. NPV memiliki beberapa keunggulan, yaitu spesifik inang, tidak merusak lingkungan, dapat mengatasi masalah resistensi hama terhadap insektisida, dan kompatibel dengan komponen PHT lainnya (Pradana, 2013).

Populasi H. talaca juga dapat dipengaruhi oleh serangga patogen salah satunya Nucleopolyhedrovirus (NPV). Hyposidra talaca pertama kali dilaporkan merusak tanaman budi daya di Indonesia pada tahun 1925. Beberapa tanaman budi daya dilaporkan diserang, yaitu teh, kopi, kina, dan coklat (Sudjarwo, 1987). Pada tahun 1970-an, H. talaca menyerang beberapa perkebunan kakao di Jawa Timur dan Sumatera Utara. Saat ini H. talaca merupakan hama penting pada tanaman teh, umumnya menyerang daun atau pucuk muda. Serangan yang berat dapat mengakibatkan daun berlubang dan pucuk gundul sehingga serangan ini dapat menyebabkan kehilangan hasil yang tinggi. Larva H. talaca merupakan hama yang dapat menyebabkan kerugian antara 40–100% pada musim kemarau jika tidak dilakukan pengendalian yang tepat (Kusumah & Halala, 2014). H. talaca memiliki musuh alami berupa predator dan parasitoid yang menyerang telur, larva, pupa, dan imago.

Karakterisasi dilakukan untuk mengetahui karakteristik molekuler NPV. Karakterisasi molekuler melalui teknik polymerase chain reaction (PCR) merupakan salah satu cara untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi suatu gen pada HytaNPV. Dalam penelitian ini, sekuens DNA polimerase digunakan untuk menganalisis filogeni dan homologi HytaNPV. Informasi filogeni dan homologi diperlukan untuk melihat kekerabatan genetik antara HytaNPV Bogor, Indonesia, dan isolat NPV yang terdaftar di GenBank. Informasi ini menunjukkan karakter molekuler HytaNPV dan tempatnya di pohon filogenetik. Penelitian ini bertujuan menganalisis kekerabatan molekuler dari HytaNPV asal Bogor melalui sekuens gen DNA polimerase dan mengukur tingkat virulensi isolat NPV yang berasal dari H. talaca.

BAHAN DAN METODE

Isolat HytaNPV merupakan koleksi dari Laboratorium Patologi Serangga yang diperoleh dari perkebunan teh Gunung Mas, Jawa Barat. Perlakuan dilakukan di Laboratorium Patologi Serangga, Laboratorium Bakteriologi, Laboratorium Nematologi, dan Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, IPB University.

Pengambilan serangga uji

Larva pengujian dikoleksi dari perkebunan teh Nirmala Agung, Jayanegara, Kabupaten Sukabumi. Larva yang dikoleksi adalah larva instar ke-2, 3, dan 4 yang sehat. Larva pengujian tidak menunjukkan ciri-ciri larva yang terkena NPV, seperti tubuh berwarna pucat, lambat bergerak, terlihat diam, dan larva menggantung di pucuk tanaman teh. Larva yang dikoleksi, kemudian dikumpulkan ke dalam kotak plastik berdasarkan instar larva.

Pengambilan sampel larva yang terinfeksi HytaNPV

Isolat virus yang akan digunakan untuk karakterisasi molekuler diperoleh dari PTPN VIII Kebun Gunung Mas dengan mengambil larva H. talaca yang mati dan menunjukkan gejala kematian akibat infeksi NPV. Ciri khas larva ulat yang mati akibat infeksi NPV di lapangan umumnya terdapat pada pucuk tanaman teh dengan posisi menggantung pada tungkai belakang membentuk huruf V. Gambar 1. Kulit larva yang terinfeksi NPV sangat rapuh sehingga larva mudah patah saat disentuh. Cairan kental berwarna kecoklatan akan keluar melalui kulit tubuh larva yang pecah(Pradana, 2013). Isolat HytaNPV yang diperoleh dari Kebun Gunung Mas disimpan dalam botol dan cool box. Isolat ini kemudian disimpan dalam lemari es pada suhu 4 °C hingga digunakan pada tahap selanjutnya.

Isolasi dan purifikasi polyhedra HytaNPV

Gambar 1.Gejala infeksi HytaNPV pada Hyposidra talaca A: kadaver larva menggantung pada tanaman teh; B: tubuh larva yang pecah mengeluarkan cairan bewarna kecoklatan.(Symptoms of HytaNPV infection in Hyposidra talaca. A: the larva cadaver hangs on the tea plant; B: the ruptured body of the larva secretes a brownish liquid.)

Larva yang mati akibat infeksi HytaNPV digerus dalam buffer SDS 0,1% hingga halus dengan menggunakan mortar steril. Penambahan SDS 0,1% dilakukan untuk mendapatkan tingkat pengenceran yang diinginkan. Suspensi ini dimasukkan ke dalam tabung mikro 1,5 ml, kemudian disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 2.000 rpm. Pelet yang terbentuk dibuang dan diambil supernatannya. Supernatan yang diperoleh kemudian disentrifugasi kembali dengan kecepatan 5.000 rpm selama 20 menit. Pelet yang diperoleh kemudian diresuspensi menggunakan akuabides. Kemudian dilakukan sentrifugasi berulang seperti semula hingga diperoleh pelet murni dengan ciri air tersuspensi jernih dan pelet berwarna kecoklatan (Cheng, 1998) Pelet hasil sentrifugasi diresuspensi dengan akuades dan diamati di bawah mikroskop dengan pembesaran 40x untuk melihat kemurnian polihedra dari pengotor.

Ekstraksi DNA HytaNPV

Ekstraksi DNA HytaNPV dilakukan dengan menggunakanmetode Cetyl-TrimethylAmmonium Bromide (CTAB) yang dimodifikasi (Doyle & Doyle, 1990) Sampel yang diekstrak terdiri atas 50 µl dan 100 µl pelet polyhedra murni. Setiap sampel dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1,5 ml kemudian ditambahkan 500 µl bufer CTAB yang mengandung 1% ß-mercaptoethanol.

Sampel kemudian diinkubasi selama 2 jam pada suhu 60 °C menggunakan penangas air dan setiap 10 menit tabung dibolak-balik hingga homogen. Setelah itu, sampel diinkubasi selama 3 menit pada suhu 28 °C, dan ditambahkan 500 µl chloroform-isoamylalcohol (24:1), kemudian disentrifugasi pada 11.000 selama 20 menit. Supernatan pada lapisan atas diambil sebanyak ½ volume larutan tanpa menyentuh pelet, kemudian ditambahkan 1/10 volume natrium asetat larutan yang diambil, dan 2/3 volume isopropanol diambil. Supernatan kemudian diinkubasi semalaman pada suhu -20 °C. Supernatan yang telah diinkubasi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit. Pelet yang terbentuk kemudian dikeringkan dengan meletakkan tabung secara perlahan di atas kertas tisu selama 2–3 jam. Pelet kering disuspensikan kembali dengan 50 µl bufer TE pH 8 dan disimpan dalam lemari es pada suhu 4 °C.

Amplifikasi DNA HytaNPV menggunakan PCR

Amplifikasi DNA HytaNPV menggunakan primer yang dirancang di Laboratorium Patologi Serangga. Primer yang digunakan adalah EDK-F (5’- CGA CGG CAA CAT CAA CGA TTA C – 3’) dan EDK-R (5’- GTG CAA TGT GCT AGC CGT AT– 3’). Setiap reaksi amplifikasi HytaNPV menggunakan 2 μl HytaNPV DNA (±40 ng/μl), 12,5 μl Dream Taq Green PCR Master Mix (2X), 1 μl forward primer, 1 μl reverse primer, dan 8,5 μl ddH₂O. Amplifikasi dengan PCR melalui beberapa tahapan, yaitu predenaturasi pada suhu 94 °C selama 4 menit, denaturasi pada suhu 94 °C selama 1 menit, annealing pada suhu 60 °C selama 1 menit, elongasi pada suhu 72 °C selama 2 menit, dan post-elongasi pada 72 °C selama 10 menit, dan 4 °C untuk suhu penyimpanan akhir hasil amplifikasi. Siklus ini diulang sebanyak 30 kali. Elektroforesis dilakukan pada gel agarosa 1% yang telah ditambahkan 1 μl FloroVueTM yang direndam dalam larutan Tris Borate EDTA (TBE) pada 50 V selama 50 menit. Hasil elektroforesis gel kemudian divisualisasikan menggunakan UV-transilluminator, dan hasil yang terlihat difoto menggunakan kamera digital.

Analisis urutan DNA, asam amino, dan homologi

Urutan DNA dari mesin sekuensing dirapikan melalui proses trimming untuk mendapatkan hasil yang lebih akurat. Trimming dilakukan karena data sekuens DNA mentah yang berasal dari mesin sekuensing umumnya memiliki beberapa faktor kesalahan dasar sehingga perlu dilakukan pembandingan dengan data lain untuk mendapatkan data yang lebih akurat(Yang et al., 2019). Sekuens hasil trimming disejajarkan menggunakan program CAP contig assembly pada program BioEdit versi 7.26 untuk mendapatkan sekuens DNA keseluruhan dari kedua pasangan primer sequencing HytaNPV (contig). Sekuens DNA contig digabungkan dengan contig HytaNPV dari penelitian sebelumnya(Sinulingga, 2017) yang menjadi dasar perancangan primer untuk mendapatkan sekuens DNA polimerase yang lebih lengkap, panjang, dan spesifik.

Hasil sekuens dianalisis menggunakan program basic local alignment search tool (BLAST) dengan program yang dioptimalkan untuk mendapatkan sekuens basa yang mirip (algoritma agak mirip/BLASTn) yang terdapat pada website National Center for Biotechnology Information (NCBI). Urutan nukleotida yang diperoleh kemudian dianalisis menggunakan multiple alignment ClustalW pada software sequence alignment editor BioEdit versi 7.2.6. Analisis homologi asam amino dilakukan dengan menerjemahkan nukleotida menggunakan www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/ dari European Bioinformatics Institution.

Analisis filogenik dilakukan dengan menggunakan pendekatan Neighbor-Joining dengan bootstrap 1.000x dengan program Molecular Evolutionary Genetic Analysis (MEGA) X.

Uji virulensi HytaNPV terhadap H. talaca

Percobaan dilakukan berdasarkan rancangan acak lengkap dengan dua faktor, yaitu konsentrasi dan instar larva. Faktor konsentrasi terdiri atas enam taraf, yaitu 0, 1,58 x 10⁷ POBs/ml, 1,58 x 10⁶ POBs/ml, 1,58 x 10⁵ POBs/ml, 1,58 x 10⁴ POBs/ ml, 1,58 x 10³ POBs/ml dan faktor instar larva terdiri atas tiga taraf, yaitu instar ke-2, 3, dan 4. Setiap ulangan terdiri atas 10 larva H. talaca. Daun teh berukuran 3 cm x 3 cm dicelupkan ke dalam suspensi NPV, kemudian daun dikeringanginkan. Daun teh selanjutnya diberikan pada larva H. talaca yang telah dipuasakan selama 12 jam. Setelah 24 jam, pakan diganti dengan daun teh yang segar. Daun teh dicelupkan ke dalam air destilata steril sebagai perlakuan kontrol.

Pengamatan mortalitas larva pada seluruh perlakuan dilakukan setiap hari selama tujuh hari. Jumlah larva yang mati setiap hari pada tiap perlakuan konsentrasi dihitung sebagai variabel yang diamati. Data diolah dengan program POLO PC. Apabila terdapat mortalitas pada perlakuan kontrol (tidak lebih dari 20%) maka mortalitas larva dikoreksi dengan formula (Abbott, 1925) dengan rumus:

<inline-formula><tex-math id="math-1"><![CDATA[ \documentclass{article} \usepackage{amsmath} \begin{document} \displaystyle P = \frac{P' - C}{P' - 100} \times 100\% \end{document} ]]></tex-math></inline-formula>

P: mortalitas terkoreksi; P’: mortalitas hasil pengamatan pada setiap perlakuan HearNPV; dan C: mortalitas pada kontrol.

HASIL

Hasil amplifikasi DNA HytaNPV menggunakan metode PCR

Hasil amplifikasi menggunakan PCR menunjukkan hasil positif berdasarkan pengamatan dengan UV-transiluminator. Hasil visualisasi menunjukkan bahwa produk PCR berukuran ±1.000 pb Gambar 2 Amplifikasi DNA HytaNPV pada penelitian ini menggunakan primer yang menargetkan urutan DNA polimerase HytaNPV pada base sequence 65.557–66.061 dari genom HytaNPV.

Analisis filogeni HytaNPV berdasarkan nukleotida dan asam amino

Pohon filogenetik berdasarkan nukleotida menggunakan metode NJ menunjukkan bahwa isolat HytaNPV Bogor berada dalam kelompok yang sama dengan Genus Buzura, isolat dari Cina dan Australia Gambar 3 Sementara, berdasarkan asam amino HytaNPV, isolat Bogor cenderung berada dalam kelompok yang sama dengan NPV dari Genus Sucra Gambar 4

Gambar 2.Visualisasi DNA HytaNPV pada agarose menggunakan UV-transiluminator. Marker 1 kb(Visualization of HytaNPV DNA on agar media using UV-transilluminator. Marker 1 kb (Thermoscientific, US), 1–5 (HytaNPV isolate Bogor, West Java))

Uji virulensi HytaNPV terhadap H. talaca

Hasil uji virulensi HytaNPV menunjukkan bahwa konsentrasi tertinggi 1,58 x 10⁷ POBs/ml dan konsentrasi terendah 1,58 x 10³ POBs/ml mengakibatkan mortalitas larva H. talaca berturut- turut sebesar 91,85 dan 59,41% pada 7 hari setelah inokulasi (HSI) Tabel 1 Persentase mortalitas larva dengan konsentrasi 1,58 x 10⁷ POBs/ml pada beberapa tingkatan instar menunjukkan nilai yang berbeda pada instar ke-2, 3, dan 4 secara berturut- turut sebesar 71; 60,49; dan 62,22% pada 7 HSI Table 2. Analisis probit menunjukkan adanya perbedaan virulensi pada ketiga tingkatan instar dengan beberapa tingkat konsentrasi yang berbeda. Perlakuan konsentrasi 1,58 x 10⁷ POBs/ml pada larva instar 2 memiliki nilai LT₅₀ tertinggi, yaitu 1,92 hari, sedangkan nilai LT₅₀ terendah sebesar 6,89 hari ditemukan pada perlakuan konsentrasi 1,58 x 10³ POBs/ml pada larva instar 4 Table 3.

PEMBAHASAN

Gambar 3.Pohon filogenetik sekuens nukleotida NPV asal Bogor dengan beberapa isolat pembandingyang diproses menggunakan metode Neighbor-Joining dengan bootstrap 1.000x.(Phylogeny of NPV DNA nucleotide sequence from Bogor () with several comparison isolates based on DNA polymerase sequences using the Neighbor-Joining method. (1.000x bootstrap)).

Gambar 4.Pohon filogenetik sekuens asam amino NPV asal Bogor dengan beberapa isolat pembandingyang diproses menggunakan metode Neighbor-Joining dengan bootstrap 1.000x.(Phylogeny of NPV DNA amino acid sequence from Bogor () with several comparison isolates based on DNA polymerase sequences using the Neighbor-Joining method. (1.000x bootstrap)).

Tabel 1.Persentase rata-rata mortalitas larva Hyposidra talaca pada perlakuan beberapa konsentrasi HytaNPV(The average mortality percentage of Hyposidra talaca larvae in several concentration of HytaNPV)

Konsentrasi HytaNPV (Concentration of HytaNPV) (POBs/ml))	Mortalitas rata-rata* (Average mortality*) (%)a
	7 HSI**
Kontrol	0,00 e
1,58 x 103	59,41 d
1,58 x 104	72,78 c
1,58 x 105	79,97 b
1,58 x 106	83,43 b
1,58 x 107	91,85 a

Table 2.Persentase rata-rata mortalitas larva Hyposidra talaca denganperlakuan HytaNPV pada beberapa tingkatan instar(The average mortality percentage of Hyposidra talaca larvae in each instar stage of H. talaca)

Instar	Mortalitas rata-rata* (Average mortality*) (%)a
	7 HSI**
2	71,00 a
3	60,49 b
4	62,22 b

Hasil pensejajaran urutan DNA dari urutan DNA polimerase HytaNPV dibandingkan dengan data DNA NPV yang tersedia di GenBank. Tahapan ini dilakukan untuk mengidentifikasi hubungan kekerabatan antar spesies NPV yang tercatat di GenBank. Selain menggunakan sekuens nukleotida, hubungan kekerabatan dan evolusi anggota Baculorividae juga dapat dianalisis menggunakan sekuens asam amino (Jose et al., 2013). Prinsip analisis hubungan kekerabatan atau homologi adalah menggunakan variasi genetik untuk melihat kekerabatan suatu organisme dengan organisme lain sehingga dapat membedakan spesies makhluk hidup berdasarkan sifat genetiknya (keanekaragaman). Berdasarkan hasil BLAST, isolat HytaNPV Bogor memiliki hubungan kekerabatan dengan berbagai isolat NPV menggunakan pencocokan nukleotida dan asam amino. Parameter yang diamati pada hasil BLAST adalah identitas dan query cover. Identitas menunjukkan persentase kesesuaian antara sekuens nukleotida sampel dan sekuens nukleotida di GenBank. Sebaliknya, query cover menunjukkan persentase panjang nukleotida sampel yang cocok dengan urutan nukleotida di GenBank(Newell et al., 2013)

Menurut (Gerdol et al., 2018) bahwa spesies yang sama, tetapi letak geografisnya berbeda dapat memiliki keragaman genetik. Tingkat keragaman genetik dalam suatu spesies dipengaruhi oleh jumlah individu, distribusi geografis, dan sistem genetik. Hasil BLAST sekuens DNA polimerase dengan nukleotida menunjukkan bahwa isolat HytaNPV Bogor memiliki kemiripan paling tinggi dengan isolat HytaNPV India dengan query cover 99%, identitas 96,68%, dan skor maks/total 5809 pb (No Akses: MH261376 .1). Berdasarkan hasil BLAST juga diketahui bahwa isolat HytaNPV asal Bogor memiliki kesamaan genetik dengan isolat Buzura suppressaria NPV asal Guangxi, China, dengan skor max/total 3377 pb, query cover 99%, identitas 81,61% (Nomor akses: KM986882.1) dan Buzura suppressaria NPV mengisolasi Hubei, China dengan skor maks/total 3376 pb, sampul kueri 99%, identitas 81,52% (No Akses: KF611977.1), dan Buzura suppressaria NPV mengisolasi Parkville, Australia dengan skor maks/total 2107 pb, query cover 54%, identitas 84,69% (Nomor akses: AF068184.1). Isolat HytaNPV Bogor juga dilakukan perbandingan BLAST dengan isolat NPV yang menyerang Ordo Lepidoptera lainnya. Isolat HytaNPV Bogor dibandingkan dengan NPV yang menyerang spesies lain, seperti Apocheima cinerarium (Erschoff), Orgyia anartoides (Walker), dan Spodoptera exigua (Hubner), menunjukkan nilaikesamaan genetik yang lebih rendah dengan query cover 36–76% dan identitas 67–70%.

Table 3.Nilai lethal time ( LT₅₀) instarlarva Hyposidra talaca pada perlakuan beberapa konsentrasi HytaNPV(The lethal time value (LT₅₀) of Hyposidra talaca larvae in several concentration of HytaNPV)

Larva (Larvae)	LT50 (HSI*)
	Konsentrasi HytaNPV (Concentration of HytaNPV) (POBs/ml)
	1,58 x 103	1,58 x 104	1,58 x 105	1,58 x 106	1,58 x 107
Instar II	4,36	3,35	2,84	2,51	1,92
Instar III	5,28	4,14	3,60	3,39	2,60
Instar IV	6,89	5,74	5,32	4,82	3,80

Berdasarkan hasil BLAST sekuens DNA polimerase menggunakan asam amino, diketahui bahwa HytaNPV asal Bogor memiliki kemiripan dengan DNA polimerase asal HytaNPV asal India dengan skor maks/total 1133/1577, query cover 87% dan identitas sebesar 79,62% (No. akses: AWW14425.1). Isolat HytaNPV Bogor juga memiliki kemiripan genetik dengan isolat Clanis bilineata NPV Qingdao, China, dengan skor maks/total 960/1568, query cover 85%, dan identitas 68,10% (No Akses: YP_717605.1). Isolat NPV yang menyerang spesies lain, seperti S. exigua, Adoxophyes orana (Fischer von Röslerstamm), Adoxophyes honmai Yasuda, Cryptophlebia peltastica (Meyrick), Lambdina fiscellaria Guenée, Orgyia leucostigma (J. E. Smith), Hemileuca sp. dan Lymantria dispar Linnaeus. Umumnya, mereka menampilkan query cover >80%, tetapi memiliki identitas rendah <55%.

Menurut (, 1991) NPV dari spesies yang sama, tetapi dari lokasi geografis yang berbeda dapat memiliki keragaman genetik yang besar. Sementara, menurut (Goto et al., 1992) Spesies Baculovirus dari spesies berbeda yang berasal dari lokasi yang sama cenderung memiliki tingkat homologi yang tinggi. Perbedaan hasil homologi antara nukleotida dan asam amino diduga terjadi karena adanya perbedaan lokasi dan pola sebaran geografis antara isolat HytaNPV Bogor dengan isolat lainnya. Perbedaan lokasi dan pola distribusi dapat menyebabkan perbedaan pengacakan gen virus dalam gen pool, yang dapat menyebabkan pergeseran dan keragaman genetik.

Analisis filogenetik memberikan pemahaman mendalam tentang bagaimana spesies berevolusi melalui perubahan genetik. Filogenetik dapat digunakan untuk mengevaluasi jalur yang menghubungkan organisme masa kini dengan asal leluhurnya, serta dapat memprediksi divergensi genetik yang mungkin terjadi di masa depan (Gorbalenya & Lauber, 2017). Pohon filogenetik berdasarkan nukleotida menggunakan metode NJ menunjukkan bahwa isolat HytaNPV Bogor berada dalam kelompok yang sama dengan Genus Buzura, isolat dari Cina dan Australia Gambar 3 Sementara, berdasarkan asam amino HytaNPV, isolat Bogor cenderung berada dalam kelompok yang sama dengan NPV dari Genus Sucra Gambar 4 Keanekaragaman genetik ini menunjukkan besarnya pengaruh kondisi lingkungan terhadap adaptasi NPV yang juga mempengaruhi susunan nukleotida dan asam amino. Hasil analisis memperkuat pernyataan bahwa kondisi geografis dan sebaran geografis inang sangat mempengaruhi tingkat keragaman genetik NPV(, 1991);(Goto et al., 1992)

Estimasi hubungan evolusi antar spesies yang lebih akurat sekarang dimungkinkan dalam analisis filogenetik molekuler menggunakan data pengurutan gen (Battistuzzi & Kumar, 2020). Analisis filogenetik dapat berguna dalam genomik komparatif, yang mempelajari hubungan antara genom dari spesies yang berbeda. Dalam konteks ini, salah satu aplikasi utamanya adalah prediksi gen atau penemuan gen, yang berarti menemukan wilayah genetik tertentu di sepanjang genom (Nagy et al., 2020) Dalam mikrobiologi, analisis filogenetik dapat diterapkan untuk mengidentifikasi dan mengklasifikasikan berbagai mikroorganisme, termasuk virus (Franco-Duarte et al., 2019)

Uji virulensi menunjukkan bahwa tingkat virulensi HytaNPV dipengaruhi oleh konsentrasi polihedra virus dan umur larva. Nilai persentase mortalitas dan nilai LT₅₀ menunjukkan tingkat virulensi virus terhadap inang. Semakin tinggi persentase mortalitas menunjukkan kemampuan virus dalam menyebabkan kematian pada populasi serangga yang diuji, sedangkan nilai LT₅₀ yang semakin rendah menunjukkan kecepatan virus dalam mengakibatkan kematian pada inang. Secara umum, Peningkatan konsentrasi virus dapat meningkatkan persentase mortalitas dan menurunkan LT₅₀ pada H. talaca, sedangkan peningkatan umur instar dapat menurunkan persentase mortalitas dan meningkatkan LT₅₀ pada H. talaca.

Peningkatan tingkat konsentrasi polihedra yang diinokulasikan mengakibatkan semakin banyak jumlah polihedra virus yang tertelan oleh larva sehingga mengakibatkan semakin banyak jaringan larva yang terinfeksi (Yasin et al., 2020) Larva yang terinfeksi HytaNPV menunjukkan gejala perubahan warna tubuh menjadi coklat kehitaman dan posisi tubuh menggantung Gambar 1Menurut (Tanada & Kaya, 1993) Larva terinfeksi NPV umumnya menunjukkan gejala tubuh melunak dan mudah pecah disertai dengan keluarnya cairan kental berwarna coklat susu dengan bau yang menyengat, serta sering ditemukan dalam posisi menggantung dengan tungkai semu menempel pada daun atau ranting tanaman.

Percobaan yang dilakukan oleh (Mukhopadhyay et al., 2011) pada isolat HytaNPV asal India dengan kerapatan 10⁶ POBs/ml dapat menyebabkan mortalitas H. talaca hingga 83,33% dengan LT₅₀ 4,05 hari. Pada kerapatan yang lebih rendah, yaitu 10³ POBs/ml, mortalitaskan larva uji mencapai 46,66% dengan LT50 5,45 hari. Kemudian perbedaan instar juga mempengaruhi virulensi HytaNPV karena adanya perbedaan tingkat kerentanan pada masing-masing instar. Menurut (Laoh & Puspita, 2003) larva instar awal memiliki organ tubuh yang lemah terutama di bagian midgut yang merupakan tempat sasaran infeksi patogen, sehingga NPV lebih mudah menembus organ dan merusak sel-sel yang rentan. Pernyataan ini didukung oleh penelitian (Vega & Kaya, 2012) yang menyatakan bahwa berdasarkan stadium inang, lama waktu kematian larva akibat infeksi NPV bervariasi dari 2 hari pada larva muda (instar-1 sampai 3) dan 4–9 hari pada larva tua (instar-4 sampai 6).

Struktur pohon filogenetik DNA polimerase yang lebih lengkap dapat menjadi indikator yang dapat diandalkan mengenai evolusi DNA polimerase. Hubungan filogenetik antara HytaNPV dan isolat lain yang terlihat dalam penelitian ini dapat menjadi penting dalam memahami adaptasi biologis antara virus dan inangnya dan untuk berkontribusi pada pemahaman kita tentang sejarah evolusi HytaNPV.

KESIMPULAN

Sekuens gen DNA polymerase pada HytaNPV asal Bogor memiliki kekerabatan genetik paling tinggi dengan HytaNPV dari India dan BuzuNPV dari China dan Australia, yang ditunjukkan berdasarkan percabangan pada pohon filogeni dan persentase kemiripan dengan analisis BLAST mencapai lebih dari 70%. Berdasarkan uji virulensi, isolat HytaNPV terhadap H. talaca menunjukkan nilai LT₅₀ tertinggi sebesar 1,92 hari pada perlakuan konsentrasi 1,58 x 10⁷ POBs/ml pada larva instar 2.

References

1. Abbott W.S.. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of Economic Entomology. 1925; 18:265-267. DOI
2. Battistuzzi F., Kumar S.. Molecular phylogeny reconstruction. eLS. 2020; 1:558-564. DOI
3. Cheng X.W.. Characterization of Nuclearpolyhedrosis viruses from Thysanplusia orichalcea (L. 1998.
4. Doyle J.J., Doyle J.L.. A rapid total DNA preparation procedure for fresh plant tissue. Focus. 1990; 12:13-15.
5. Federici B.A.. The Baculoviruses. Springer Science + Business: Springer Science + Business; 1997:33-56. DOI
6. Franco-Duarte R., Černáková L., Kadam S., Kaushik S., K Salehi, B Bevilacqua, A Corbo, MR Antolak, H Dybka-Stępień, K Leszczewicz, M Relison Tintino, S Alexandrino de Souza, VC Sharifi-Rad, J Melo Coutinho, HD Martins, N Rodrigues, C.F.. Advances in chemical and biological methods to identify microorganisms—from past to present. Microorganisms. 2019; 7(130)DOI
7. Gerdol M., Zhao H., Wang Y., Xing F., Liu X., Yuan C., Qi G., Guo J., Dong Y.. The genetic diversity and geographic differentiation of the wild soybean in northeast China based on nuclear microsatellite variation. International Journal of Genomics. 2018; 2018(8561458)DOI
8. Gorbalenya A.E., Lauber C.. Reference Module in Biomedical Sciences. ; 2017. DOI
9. Goto C., Minobe Y., Izuka T.. Restriction endonuclease analysis and mapping of the genomes of granulosis viruses isolated from Xestia c-nigrum and five other noctuid species. Journal of General Virology. 1992; 73(149)DOI
10. Jose J., Jalali S.K., Shivalingaswamy T.M., Kumar N.K.K., Bhatnagar R., Bandyopadhyay. Molecular characterization of nucleopolyhedrovirus of three Lepidopteran pest using late expression factor-8 gene. Indian Journal of Virology. 2013; 24:59-65. DOI
11. Kusumah Y.M., Halala Y.T.. Prosiding Seminar Nasional Perlindungan Tanaman II: Strategi Perlindungan Tanaman dalam Memperkuat Sistem Pertanian Nasional Menghadapi ASEAN Free Trade Area (AFTA) dan ASEAN Economic Community (AEC) 2015. PKPHT: PKPHT; 2014:45-58.
12. Laoh J.H., Puspita F.. Kerentanan larva Spodoptera litura F. terhadap virus nuklear polyhedrosis. Jurnal Natur Indonesia. 2003; 5:145-151.
13. Mukhopadhyay A., Khewa S., De D.. Characteristics and virulence of nucleo-polyhedrovirus isolated from Hyposidra talaca (Lepidoptera: Geometridae), a pest of tea in Darjeeling Terai, India. International Journal of Tropical Insect Science. 2011; 31:13-9. DOI
14. Nagy L.G., Merényi Z., Hegedüs B., Bálint B.. Novel phylogenetic methods are needed for understanding gene function in the era of mega-scale genome sequencing. Nucleic Acids Research. 2020; 48:2209-2219. DOI
15. Newell P.D., Fricker A.D., Roco C.A., Chandrangsu P., Merkel S.M.. A small-group activity introducing the use and interpretation of BLAST+. Journal of Microbiology & Biology Education. 2013; 14:238-243. DOI
16. Pradana R.. dengan Aplikasi Hyposidra talaca Nucleopolyhedrovirus pada Tanaman Teh di PT Perkebunan Nusantara VIII Gunung Mas Bogor, Jawa Barat. Skripsi. Institut Pertanian Bogor: Institut Pertanian Bogor; 2013.
17. DNA restriction polymorphism in wild isolates of Spodoptera frugiperda nuclear polyhedrosis virus. Journal of Invertebrate Pathology. 1991; 58:96-105. DOI
18. Sinulingga P.. Institut Pertanian Bogor: Bogor; 2017.
19. Sudjarwo. Geometridae: Lepidoptera; 1987.
20. Tanada Y., Kaya H.K.. Academic Press: California; 1993.
21. Vega F.E., Kaya H.K.. Academic Press: California; 2012.
22. Williams T., GdC Melo-Molina, Jiménez-Fernández J.A., Weissenberger H., Gómez-Díaz J.S., Navarro-de-la-Fuente L., Richards A.R.. Presence of Spodoptera frugiperda multiple Nucleopolyhedrovirus (SfMNPV) occlusion bodies in maize field soils of mesoamerica. Insects. 2023; 14(80)DOI
23. Yang S.F., Lu C.W., Yao C.T., Hung C.M.. To trim or not to trim: Effects of read trimming on the de novo genome assembly of a widespread East Asian Passerine, the Rufous-capped Babbler (Cyanoderma ruficeps Blyth. Genes. 2019; 10(737)DOI
24. Yasin M., Qazi M.S., Wakil W., Qayyum M.A.. Evaluation of nuclear polyhedrosis virus (NPV) and emamectin benzoate against Spodoptera litura (F.) (Lepidoptera: Noctuidae. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 2020; 30:1-6. DOI
25. Xu Yi-Peng, Cheng Ruo-Lin, Xi Yu, Zhang Chuan-Xi. Genomic diversity of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus strains. Genomics. 2013; 102:63-71. DOI