Desain primer secara in silico dan optimasi PCR untuk deteksi gen penyandi ovary ecdysteroidogenic hormone (OEH) pada nyamuk Aedes aegypti yang terinfeksi Wolbachia

In silico primer design and PCR optimization for detection of the gene encoding ovary ecdysteroidogenic hormone (OEH) in Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia

Female Aedes aegypti (Linnaeus) mosquitoes bearing Wolbachia are reported to have behavioral changes during mating and blood-sucking. The ovary ecdysteroidogenic hormone (OEH) is a hormone released when female mosquitoes consume blood so that it influencing egg formation. Initial studies regarding the genetics of the A. aegypti mosquito carrying Wolbachia are very necessary to able to do this help control dengue vectors. The polymerase chain reaction (PCR) method is an appropriate method for genetic studies. Primer design is an initial and crucial stage in genetic studies because designing specific primers will determine the success of the PCR process. This research includes several stages of in silico primer design to design OEH gene primers and test the optimization of the in vitro designed primers. The in silico stage which involves primer design, primer BLAST, primer quality testing, and in silico PCR simulations. The designed primers were tested in vitro by performing PCR using various variations in primer concentration (0.2 µM and 0.4 µM) and annealing temperature (start from 45 ^oC to 60 ^oC). The results obtained in silico were two pairs of primers: primers OEH 8 and OEH 9. The results of the in silico test obtained a DNA product size of 264 bp for Primer OEH 8 and 236 bp for primer OEH 9, and the PCR efficiency was 95%. The results of the in vitro test showed only primer OEH 9 met the primer criteria according to the in silico test: primer concentration of 0.4 µM with an annealing temperature of 57 ^oC.

PENDAHULUAN

Penyakit demam dengue (DD) merupakan penyakit endemik di wilayah tropis dan subtropis. Pengembangan strategi baru dengan memanfaatkan teknologi terkini telah dilakukan untuk mengendalikan transmisi virus dengue, yaitu pemanfaatan bakteri endosimbiotik Wolbachia (Saraswati et al., 2023). Potensi penerapan bakteri simbiosis Wolbachia merupakan upaya untuk pengendalian penyakit dengue melalui penyebaran vektor dengan senjata alami (Iturbe-Ormaetxe et al., 2011). Bakteri ini secara alami ditemukan pada 50% spesies arthropoda, isopoda, serta nematoda dan dinyatakan aman untuk manusia, hewan, dan lingkungan sekitarnya (Zhou & Li, 2016); (Werren et al., 2008). Pengembangan strategi pengendalian DD telah dilakukan dengan memanfaatkan bakteri endosimbiotik Wolbachia yang diinfeksikan ke nyamuk Aedes aegypti (Linnaeus) (Walker et al., 2011); (Buchori et al., 2022); (Ye et al., 2015). Inovasi teknologi Wolbachia terbukti efektif di 14 negara serta telah diakui oleh WHO sebagai teknologi pengendalian vektor dengue (Buchori et al., 2022). Sementara di Indonesia efektifitas teknologi Wolbachia ini terbukti menurunkan kasus dengue 77% dan penurunan pasien rawat inap sebanyak 86% di Yogyakarta (Buchori et al., 2022).

Dampak kehadiran Wolbachia di dalam tubuh nyamuk A. aegypti berakibat pada perubahan tingkah laku nyamuk betina dalam menghisap darah sehingga menyebabkan ketidaknormalan reproduksi dan berdampak pada kelangsungan hidup telur dan larva nyamuk (Irfandi, 2018); (McMeniman & O’Neill, 2010); (Crain et al., 2011). Dampak yang perlu diperhatikan juga adalah adanya ketidakmampuan nyamuk dalam bertahan hidup di alam liar yang akan menyebabkan proses pelepasan nyamuk Wolbachia oleh pemerintah harus disokong secara terus menerus (Irfandi, 2018). Kajian genetik perlu dilakukan mengingat kemampuan nyamuk Wolbachia di alam belum banyak diketahui dari aspek genetik. Gen neurotranscriptome penyandi ovary ecdysteroidogenic hormone (OEH) merupakan gen yang dapat dijadikan acuan studi genetik nyamuk untuk mengetahui perubahan prilaku nyamuk betina, seperti perkawinan dan kemampuan mengkonsumsi darah serta merupakan area studi intensif bagi pengendalian vektor (Matthews et al., 2016). Hormon ini dilepaskan oleh otak pada saat nyamuk betina mengkonsumsi darah sehingga merangsang pembentukan telur (Gulia-Nuss et al., 2015). Studi genetik ini merupakan studi pendahuluan untuk dapat membantu kajian dalam aspek pengendalian vektor DD.

Penelitian terdahulu telah dilakukan oleh beberapa ahli yang mengangkat studi atau kajian tentang nyamuk A. aegypti yang terinfeksi Wolbachia,yaitu dampak perubahan perilaku nyamuk serta perubahan fenotipe nyamuk (Iturbe-Ormaetxe et al., 2011); (Irfandi, 2018). Sementara kajian genetik telah banyak dilakukan pada nyamuk A. aegypti alami, seperti ditemukannya pengaruh steroidogenic neurohormone pada nyamuk betina dan ditemukannya sekuen penyandi OEH (Gulia-Nuss et al., 2015); (Brown et al., 1998). Hormon tersebut berpengaruh terhadap perilaku nyamuk betina dalam menghisap darah dan reproduksi telur. Namun, kajian genetik mengenai perubahan perilaku nyamuk A. aegypti yang terinfeksi Wolbachia masih tergolong baru khususnya yang berpanguh terhadap perubahan perilaku mengisap darah dan reproduksi nyamuk yang berkaitan dengan hormon OEH. Perancangan primer diperlukan sebagai penelitian pendahuluan mengenai studi genetik gen OEH serta menguji primer tersebut untuk mendapatkan kondisi optimal sehingga dapat menghasilkan produk PCR yang baik.

Metode polymerase chain reaction (PCR) merupakan metode yang umum digunakan untuk studi genetik. Metode PCR merupakan metode amplifikasi DNA secara enzimatis dengan bantuan enzim polimerase (Borah, 2011). Desain primer merupakan tahapan yang sangat krusial dalam studi genetik karena perancangan primer yang spesifik akan menentukan keberhasilan proses PCR (Deratih & Achyar, 2021). Uji in silico merupakan uji secara bioinformatika yang dapat diuji kebenarannya. Penelusuran secara in silico juga akan memudahkan para peneliti untuk mengetahui kemungkinan resiko yang akan didapatkan sebelum mulai pada penelitian in vitro. Oleh karena itu, uji in silico sangat penting untuk dilakukan terutama pada penelitian beresiko tinggi, seperti desain primer yang akan dilakukan dengan menggunakan metode PCR (Parikesit et al., 2017). Tujuan penelitian ini adalah melakukan rancangan primer gen OEH secara in silicodan mengetahui kondisi optimal primer yang dirancang untuk dapat menghasilkan amplifikasi pada daerah gen OEH secara in vitro.

BAHAN DAN METODE

Desain primer gen penyandi OEH dan uji kualitas primer secara in silico

Desain primer menggunakan website National Center for Biotechnology Information (NCBI) yang dapat diakses pada laman https://www.ncbi.nlm.nih.gov. Cetakan DNA A. aegypti diperoleh dari penelusuran protein OEH dari GenBank NCBI dengan nomor aksesi U69542.1. Kandidat pasangan primer ditunjukkan pada laman pick primer pada program NCBI. Kandidat primer yang dipilih, diuji secara in silico dengan software FastPCR. Uji in silico meliputi perkiraan lokasi penempelan primer, pemilihan nilai melting temperature (Tm), presentase kandungan jumlah basa G (guanin) dan C (sitosin) (GC%), adanya seft 3` complementarity, dan perkiraan ukuran produk PCR (Pradnyaniti & Yowani, 2013); (Sasmitha et al., 2018).

Optimasi primer gen OEH secara in vitro dengan metode PCR

Persiapan, lokasi, dan waktu penelitian. Penelitian telah lolos kajian etik di Poltekes Kemenkes Denpasar dengan Nomor Persetujuan Etik: DP.04.02/F.XXXII.25/0664/2024. Sampel nyamuk A. aegypti betina dikoleksi di dua tempat, yaitu nyamuk A. aegyptiwild type dikoleksi di Unit Laboratorium Biomedik Terpadu,Fakultas Kedokteran, Universitas Udayana dan nyamuk A. aegypti ber-Wolbachia dikoleksi di Labkesmas Kesehataan Lingkungan Salatiga pada bulan Mei–Agustus 2024.

Pelaksanaan penelitian secara in vitro.

Sampel nyamuk diambil dengan purposive sampling. Sebanyak 20 individu nyamuk diekstraksi dengan DNA Extraction and Purification KIT (Qiagen). Sampel nyamuk A.aegypti ber-Wolbachia di konfirmasi kembali dengan menggunakan protokol skriningWolbachia dengan metode real time PCR Taqman Assay (WMP Protocol). Setelah konfirmasi amplifikasi DNA dilakukan dengan menggunakan primer OEH yang dirancang. Optimasi primer dilakukan dengan beberapa kombinasi variasi formula PCR dan variasi program PCR.

a. Formula PCR

Optimasi formula PCR dilakukan dengan komposisi campuran PCR Mix (Go Taq Green Master Mix PCR Promega) 1X, DNA 25 ng/ul dan konsentrasi primer dengan variasi 0,2 μM dan 0,4 μM.

b. Program PCR

PCR dijalankan pada mesin Thermo Cyler/mesin PCR merk Veriti. Program PCR yang dijalankan, yaitu tahapan denaturasi 30 detik pada suhu 94 oC, tahapan annealing divariasikan dimulai dari suhu 45 oC sampai 60 oC selama 30 detik, dan tahapan extension selama 30 detik dengan suhu 72 oC. Program ini diulang sebanyak 35 kali.

Tahap visualisasi produk PCR dilakukan dengan teknik elektroforesis pada konsentrasi gel agarosa 1,5%. Hasil elektroforesis kemudian dilihat dengan menggunakan Gel-Doc (Biorad) (Septiasari, 2022). Interpretasi hasil dan analisis data yang digunakan dalam penelitian ini adalah analisis deskriptif dengan melihat kualitas pita DNA. Perhitungan ukuran pita DNAdiketahui dengan membuat grafik semilog dan di konfirmasi dengan pengolahan grafik logaritma (Anam et al., 2021). Ukuran pita DNA yang didapatkan dikonfir-masi dengan bank data dari pengujian PCR in silico.

HASIL

Kualitas primer secara in silico

Desain primer secara in silico didapatkan gen penyandi OEH memiliki panjang basa sekitar 973 basa. Berdasarkan hasil desain primer menggunakan analisis pick primer pada website NCBI, didapatkan 10 kandidat pasangan primer. Pasangan primer OEH 8 dan OEH9 merupakan primer yang sesuai dengan posisi gen yang diinginkan. Posisi primer OEH8 memiliki pada basa 82–345, sedangkan primer OEH9 berada pada posisi 326–561. Uji primer secara in silico dan PCR in silico dilakukan dengan software FastPCR. Hasil uji menunjukkan kedua pasangan primer memiliki efisiensi 95% dengan perkiraan produk PCR, yaitu 264 pb untuk primer OEH 8 dan 236 pb untuk primer OEH 9 Table 1.

Hasil optimasi primer OEH secara in vitro

Hasil optimasi primer OEH 8 pada nyamuk A. aegypti wild type menunjukkan tidak adanya amplifikasi pada konsentrasi primer 0,2 µM, sedangkan pada konsentrasi primer 0,4 µM, amplifikasi ditunjukkan pada suhu annealing 45 oC, 46 oC, 47 oC, dan 48 oC. Suhu annealing yang optimal terdapat pada suhu 47 oC yang ditandai dengan pita yang jelas dan spesifik Gambar 1. Nyamuk A. aegypti wolbachia menunjukkan adanya amplifikasi pada konsentrasi primer 0,4 µM dengan suhu annealing yang rendah, yaitu 45 oC. Namun, hasil visualisasi tidak spesifik karena ukuran pita DNA yang dihasilkan lebih dari 1000 pb (Table 2 dan Gambar 2).

Hasil optimasi primer OEH 9 pada nyamuk A. aegypti wild type maupun A. aegypti wolbachia menunjukkan amplifikasi pada konsentrasi primer 0,4 µM pada suhu annealing 47 oC, 49 oC, 51 oC, 53 oC, 55 oC, 57 oC, dan 59 oC. Optimasi primer OEH 9 pada kedua nyamuk mendapatkan hasil yang spesifik pada konsentrasi 0,4 µM dengan suhu annealing 57 oC (Table 3; Gambar 3; Gambar 4).

Table 1.Hasil polymerase chain reaction (PCR) secara in silico

Nama primer (Primer name)	Panjang (Length)	Lokasi (Location)	Tm	GC%	Self 3` complemen- tarity	Organisme yang diprediksi (Primer blast predicted organism)	Efisiensi PCR primer (Primer PCR efficiency)	Amplikon (pb)
OEH8-F OEH8-R	20 20	82 345	59,82 59,82	55,0 55,0	1,00 1,00	Aedes aegypti	95%	264
OEH9-F OEH9-R Tm: melting temper	20 20 ature; pb: pasa	326 561 ng basa; OEH:	59,82 59,76 ovary ec	55,0 55,0 dysteroid	0,00 0,00 ogenic hormone	A. aegypti Aedes albopictus ; GC: ...	95%	236

Gambar 1.Optimasi primer OEH 8 pada Aedes aegyptiwild type. Gambar merupakan kombinasi variasi suhu annealing dan konsentrasi primer yang berbeda. A: merupakan kombinasi konsentrasi primer 0,2 μM; B: merupakan kombinasi konsentrasi primer 0,4 μM dengan keterangan suhu A1/B1: 45 oC; A2/B2: 46 oC; A3/B3: 47 oC; A4/B4: 48 oC; A5/B5: 49 oC; A6/B6: 50 oC; A7/B7: 53 oC; A8/B8: 56 oC; A9/B9: 57 oC; A10/B10: 58 oC; A11/B11: 59 oC; dan A12/B12: 60 oC.

Gambar 2.Optimasi primer OEH 8 pada Aedes aegypti ber-Wolbachia. Gambar di atas merupakan kombinasi variasi suhu annealing dan konsentrasi primer yang berbeda. A: merupakan kombinasi konsentrasi primer 0,2 μM dan B: merupakan kombinasi konsentrasi primer 0,4 μM dengan keterangan suhu A1/B1: 45 oC; A2/B2: 46 oC; A3/B3: 47 oC; A4/B4: 48 oC; A5/B5: 49 oC; A6/B6: 50 oC; A7/B7: 53 oC; A8/B8: 56 oC; A9/B9: 57 oC; A10/B10: 58 oC; A11/B11: 59 oC; dan A12/B12: 60 oC.

PEMBAHASAN

Hasil penelusuran dengan GenBank ditemukan gen penyandi OEH memiliki panjang total sebesar 973 pb. Desain primer secara in silico pada daerah gen penyandi ovary ecdysteroidogenic hormone (OEH) dengan software NCBI, ditemukan sebanyak 10 pasang kandidat primer yang mengamplifikasi daerah gen OEH. Dua kandidat pasangan primer terbaik dilakukan pengujian secara in silico dengan melakukan uji kualitas primer dan in silico PCR dengan software FastPCR. Primer OEH8 dan primer OEH9 ditentukan menjadi kandidat primer untuk penyandi daerah gen OEH Table 1. Penentuan primer yang optimal memenuhi kriteria penentuan primer, yaitu mewakili lokasi amplifikasi pada wilayah target, panjang oligonukleotida primer yang ideal, nilai temperature melting (Tm), persentase nilai GC, dan kemungkinan kemunculan dimer antar primer (Septiasari, 2022).

Table 2.Optimasi primer OEH 8

Variasi suhu annealing pada PCR (Annealing temperature variations on PCR)	Konsentrasi primer (Primer concentration) (Aedes aegypti wild type)		Keterangan (Information)	Konsentrasi primer (Primer concentration) (Aedes aegypti ber-Wolbachia (bearing Wolbachia))		Keterangan (Information)
	0,2 µM	0,4 µM		0,2 µM	0,4 µM
45 oC	-	+	Tidak spesifik (Unspecific)	-	+	Tidak spesifik (Unspecific)
46 oC	-	+	Tidak spesifik(Unspecific)	-	-	Tidak ada pita (No band)
47 oC	-	+	Spesifik (specific)	-	-	Tidak ada pita (No band)
48 oC	-	+	Lemah (weak)	-	-	Tidak ada pita (No band)
49 oC	-	-	Tidak ada pita (No band)	-	-	Tidak ada pita (No band)
50 oC	-	-	Tidak ada pita (No band)	-	-	Tidak ada pita (No band)
53 oC	-	-	Tidak ada pita (No band)	-	-	Tidak ada pita (No band)
56 oC	-	-	Tidak ada pita (No band)	-	-	Tidak ada pita (No band)
57 oC	-	-	Tidak ada pita (No band)	-	-	Tidak ada pita (No band)
58 oC	-	-	Tidak ada pita (No band)	-	-	Tidak ada pita (No band)
59 oC	-	-	Tidak ada pita (No band)	-	-	Tidak ada pita (No band)
60 oC	-	-	Tidak ada pita (No band)	-	-	Tidak ada pita (No band)

Table 3.Optimasi primer OEH 9

Variasi suhu annealing pada PCR (Annealing temperature variations on PCR)	Konsentrasi primer (Primer concentration) (Aedes aegypti wild type)		Keterangan (Information)	Konsentrasi primer (Primer concentration) (Aedes aegypti ber-Wolbachia (bearing Wolbachia))		Keterangan (Information)
	0,2 µM	0,4 µM		0,2 µM	0,4 µM
45 oC	-	-	Tidak ada pita (No band)	-	-	Tidak ada pita (No band)
47 oC	-	+	Tidak spesifik (Unspecific)	-	+	Tidak spesifik (Unspecific)
49 oC	-	+	Tidak spesifik (Unspecific)	-	+	Tidak spesifik (Unspecific)
51 oC	-	+	Tidak spesifik (Unspecific)	-	+	Tidak spesifik (Unspecific)
53 oC	-	+	Tidak spesifik (Unspecific)	-	+	Tidak spesifik (Unspecific)
55 oC	-	+	Tidak spesifik (Unspecific)	-	+	Spesifik (specific)
57 oC	-	+	Spesifik (specific)	-	+	Spesifik (specific)
59 oC	-	+	Lemah (weak)	-	+	Lemah (weak)
60 oC	-	-	Tidak ada pita (No band)	-	-	Tidak ada pita (No band)

Gambar 3.Optimasi primer OEH 9 pada Aedes aegyptiwild type. Gambar merupakan kombinasi variasi suhu annealingdan konsentrasi primer yang berbeda. A: merupakan kombinasi konsentrasi primer 0,2 μM dan B: merupakan kombinasi konsentrasi primer 0,4 μM dengan keterangan suhu A1/B1: 45 oC; A2/B2: 47 oC; A3/B3: 49 oC; A4/B4: 51 oC; A5/B5: 53 oC; A6/B6: 55 oC; A7/B7: 57 oC; A8/B8: 59 oC; dan A9/B9: 60 oC.

Gambar 4.Optimasi primer OEH 9 pada Aedes aegypti ber-Wolbachia. Gambar diatas merupakan kombinasi variasi suhu annealing dan konsentrasi primer yang berbeda. A: merupakan kombinasi konsentrasi primer 0,2 μM dan B: merupakan kombinasi konsentrasi primer 0,4 μM dengan keterangan suhu A1/B1: 45 oC; A2/B2: 47 oC; A3/B3: 49 oC; A4/B4: 51 oC; A5/B5: 53 oC; A6/B6: 55 oC; A7/B7: 57 oC; A8/B8: 59 oC; dan A9/B9: 60 oC.

Primer OEH8 merupakan pasangan primer yang terpilih karena memiliki lokasi penempelan pada basa ke 82 sampai basa ke 345 dari gen OEH, sedangkan primer OEH 9 memiliki lokasi ke 326 sampai 561. Maka,diperkirakan mewakili sebagian besar wilayah OEH yang memiliki total panjang 973 pb.

Proses amplifikasi memerlukan primer yang spesifik agar dapat menghasilkan produk PCR yang ideal. Jumlah nukleotida yang membentuk primer juga sangat berpengaruh terhadap proses amplifikasi. Menurut (Sasmitha et al., 2018), panjang primer berkisar 18–30 oligonukleotida. Jika kurang dari 18 oligonukleotida maka akan menyebabkan terjadinya penempelan primer pada tempat yang tidak spesifik, namun jika lebih dari 30 basa maka antar primer akan terjadi proses hibridasi dan akan menghambat terjadinya amplifikasi DNA (Sasmitha et al., 2018).

Nilai Tm adalah suhu saat untaian ganda DNA terpisah sebanyak 50%. Nilai Tm yang optimal berkisar 50–65oC,sedangkan selisih antar primer yang direkomendasikan paling banyak sekitar 5oC. Jika suhu Tm terlalu tinggi akan mempengaruhi proses amplifikasi DNA, namun jika terlalu rendah akan mengakibatkan munculnya unspecific product akibat dari penempelan primer pada sekuen yang tidak diinginkan (Pradnyaniti & Yowani, 2013).

Persentase jumlah G-C merupakan persentase banyaknya basa guanin dan sitosin pada primer. Persentase G-C yang optimal berada pada rentang 40–60%. Persentase G-C dapat mempengaruhi Tm suatu primer dan dapat mempengaruhi suhu pemisahan rantai ganda primer dan DNA template (Sasmitha et al., 2018). Sementara, primer dengan persentase G-C yang rendah dapat menurunkan efisiensi proses PCR (Borah, 2011) (Sasmito et al., 2014). Kemungkinan munculnya dimer antar primer juga mempengaruhi penentuan pasangan primer. Dimer pada ujung 3` primer sebaiknya tidak lebih dari 3 basa karena akan mempengaruhi spesifisitas dari primer (Pradnyaniti & Yowani, 2013).

Primer OEH9 memiliki kondisi optimal untuk menghasilkan amplifikasi pada konsentrasi primer 0,4 μM dengan suhu annealing 57oC. Kondisi ini ditentukan berdasarkan analisis tahapan elektroforesis menghasilkan pita DNA single band yang spesifik Table 3. Konsentrasi primer sangat menentukan keberhasilan proses amplifikasi karena konsentrasi yang optimal akan menghasilkan gambaran amplifikasi yang jelas dan spesifik. Konsentrasi primer yang terlalu rendah mengakibatkan proses amplifikasi tidak terjadi. Hal tersebut terjadi akibat tidak cukupnya kuantitas primer dalam menjalankan proses PCR, namun jika konsentrasi terlalu tinggi menyebabkan adanya template DNA belum teramplifikasi secara sempurna menyebabkan pita DNA yang tipis dan samar (Setyawati & Zubaidah, 2021).

Selain konsentrasi primer, suhu annealingmerupakan faktor penentu dari optimasi primer karena berpengaruh terhadap program PCR yang dapat menghasilkan hasil amplifikasi yang baik. Suhu annealing yang tinggi menyebabkan ikatan hidrogen antara basa nitrogen pada primer dan template DNA menjadi lemah sehingga primer tidak dapat menempel dengan kuat dan spesifik. Suhu annealing yang terlalu rendah juga dapat menyebabkan hasil amplifikasi tidak optimal karena primer akan menempel tidak hanya pada DNA target dan mengakibatkan hasil amplifikasi tidak spesifik (Sasmito et al., 2014).

Hasil optimasi primer OEH8 pada nyamuk A. aegypti wild type dan A. aegypti ber-Wolbachia Table 2 mendapatkan hasil yang berbeda, yaitu primer OEH8 pada sampel A. aegypti ber-Wolbachia menunjukkan adanya amplifikasi pada suhu rendah, yaitu 45 oC pada konsentrasi 0,4 μM. Berdasarkan uji in silico ukuran amplikon PCR pada primer OEH8 sekitar 264 pb,namun pada hasil eletroforesis menunjukkan ukuran panjang amplikon sebesar lebih dari 1000 pb sehingga diperkirakan gen yang teramplifikasi bukan gen OEH 8. Pada A.aegyptiwild type ditunjukkan hasil optimal pada proses PCR pada konsentrasi 0,4 μM dengan suhu annealing 47 oC, sedangkan pada sampel nyamuk A. aegypti ber-Wolbachia tidak mendapatkan produk amplifikasi. Dugaan sementara primer OEH8 dapat membedakan nyamuk A. aegyptiwild type dengan A. egypti ber-Wolbachia, tetapi pernyataan ini perlu dilakukan konfirmasi lebih lanjut dengan pendekatan analisis mutasi DNA pada A. aegypti ber-Wolbachia dengan teknik sekuensing.

Tahapan in silico merupakan tahapan yang dapat memprediksi minimalisisr kesalahan pada saat melakukan PCR secara in vitro (Parikesit et al., 2017). Pada penelitian ini, desain primer dan uji primer secara in silico dapat memprediksi ukuran produk DNA, lokasi penempelan primer, dan efisiensi PCR primer. Primer OEH8 dan OEH9 yang didesain telah memenuhi persyaratan uji primer. Namun, hanya primer OEH9 yang didesain ini dapat mengamplifikasi wilayah target dengan tepat sesuai yang telah dirancang secara in silico. Hal ini menunjukan bahwa primer OEH9 yang didesain sudah cukup baik untuk dapat digunakan dalam proses PCR dan dapat menghasilkan produk sesuai dengan rentang daerah yang diinginkan.

KESIMPULAN

Desain primer yang spesifik pada daerah target gen penyandi ovary ecdysteroidogenic hormone (OEH), yaitu dengan nama primer OEH 8 dan OEH 9. Hasil uji in silico memperoleh ukuran produk DNA, yaitu 264 pb untuk primer OEH 8 dan 236 pb untuk primer OEH 9, serta efisiensi PCR kedua primer, yaitu 95%. Hasil uji secara in vitro menunjukkan hanya primer OEH 9 yang memenuhi kriteria primer sesuai uji in silico, yaitu konsentrasi primer 0,4 µM dengan suhu annealing 57 oC.

References

1. Anam K., Cahyadi W., Azmi I., Senjarini K., Oktarianti R.. Analisis hasil elektroforesis DNA dengan image processing menggunakan metode gaussian filter. Indonesian Journal of Electronics and Instrumentation Systems. 2021; 11:37-48. DOI
2. Borah P.. Primer designing for PCR. Science Vision. 2011; 11:134-136.
3. Buchori D., Mawan A., Nurhayati I., Aryati A., Kusnanto H., Hadi U.K.. Risk assessment on the release of Wolbachia-infected Aedes aegypti in Yogyakarta, Indonesia. Insects. 2022; 13(924)DOI
4. Brown M.R., Graf R., Swiderek K.M., Fendley D., Stracker T.H., Champagne D.E.. Identification of a steroidogenic neurohormone in female mosquitoes. Journal of Biological Chemistry. 1998; 273:3967-3971.
5. Crain P.R., Mains J.W., Suh E., Huang Y., Crowley P.H., Dobson S.L.. Wolbachia infections that reduce immature insect survival: Predicted impacts on population replacement. BMC Evolutionary Biology. 2011; 11(290)DOI
6. Deratih B.P., Achyar A.. Primer design and in silico PCR for detection Shigella sp. on refilled water samples. Serambi Biologi. 2021; 6:1-6.
7. Gulia-Nuss M., Elliot A., Brown M.R., Strand M.R.. Multiple factors contribute to anautogenous reproduction by the mosquito Aedes aegypti. Journal of Insect Physioogyl. 2015; 82:8-16. DOI
8. Irfandi A.. Kajian pemanfaatan Wolbachia terhadap pengendalian DBD (studi literatur dan studi kasus pemanfaatan Wolbachia di Yogyakarta. Forum Ilmiah. 2018; 15:276-89.
9. Iturbe-Ormaetxe I., Walker T., O’Neill S.L.. Wolbachia and the biological control of mosquito-borne disease. EMBO Reports. 2011; 12:508-518. DOI
10. Matthews B.J., McBride C.S., DeGennaro M., Despo O., Vosshall L.B.. The neurotranscriptome of the Aedes aegypti mosquito. BMC Genomics. 2016; 17(32)DOI
11. McMeniman C.J., O’Neill S.L.. A virulent Wolbachia infection decreases the viability of the dengue vector Aedes aegypti during periods of embryonic quiescence. PLoS Neglected Tropical Diseases. 2010; 13(748)DOI
12. McMeniman C.J., V. Lane R., Cass B.N., Fong A.W.C., Sidhu M., Wang Y.F.. Stable introduction of a life-shortening Wolbachia infection into the mosquito Aedes aegypti. Science. 2009; 323:141-144. DOI
13. Parikesit A.A., D Anugoro, RA Putranto. Pemanfaatan bioinformatika di bidang pertanian dan kesehatan. Menara Perkebunan. 2017; 85:105-115. DOI
14. Pradnyaniti D.G., Yowani S.. Desain primer secara in silico untuk amplifikasi fragmen gen rpoB Mycobacterium tuberculosis dengan polymerase chain reaction (PCR. Jurnal Farmasi Udayana. 2013; 2:124-127.
15. Saraswati U., Supriyati E., Rahayu A., Rovik A., Kurniasari I., Hermantara R.. Kajian aspek keamanan nyamuk Aedes aegypti Linnaeus ber-Wolbachia di Yogyakarta, Indonesia. Jurnal Entomologi Indonesia. 2023; 20:117-128. DOI
16. Sasmitha V.L., Sanna Yustiantara P., Yowani Sagung Chandra. Desain DNA primer secara in silico sebagai pendeteksi mutasi gen gyrA Mycrobacterium tuberculosis untuk metode polymerase chain reaction. Cakra Kimia (Indonesian E-Journal of Applied Chemistry. 2018; 6:63-69.
17. Sasmito D.E.K., Kurniawan R., Muhimmah I.. Karakteristik primer pada polymerase chain reaction (PCR) untuk sekuensing DNA. Mini Review. Seminar Nasional Informatika Medis. 2014; V:93-102.
18. Septiasari N.P.S.. Optimasi PCR dengan penanda daerah D-loop DNA mitokondria untuk metode tes DNA. Indonesian Journal of Legal and Forensic Sciences. 2022; 12:76-83. DOI
19. Setyawati R., Zubaidah S.. Optimasi konsentrasi primer dan suhu annealing dalam mendeteksi gen leptin pada sapi peranakan ongole (PO) menggunakan polymerase chain reaction (PCR. Indonesian Journal of Laboratory. 2021; 4:36-40. DOI
20. Walker T., Johnson P.H., Moreira L.A., Iturbe-Ormaetxe I., Frentiu F.D., McMeniman C.J.. The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations. Nature. 2011; 476:450-453. DOI
21. Werren J.H., Baldo L., Clark M.E.. Wolbachia: Master manipulators of invertebrate biology. Nature Reviews Microbioogyl. 2008; 6:741-51. DOI
22. Ye Y.H., Carrasco A.M., Frentiu F.D., Chenoweth S.F., Beebe N.W., Hurk A.F.. Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 2015; 9:e0003894DOI
23. Zhou X.F., Li Z.X.. Establishment of the cytoplasmic incompatibility-inducing Wolbachia strain wMel in an important agricultural pest insect. Scientific Reports. 2016; 6(39200)DOI