Identifikasi molekuler lepidopteran predator Coccidae pada tanaman kopi di Sukabumi

Molecular identification of predatory Lepidoptera of Coccidae on coffee plants in Sukabumi

Abstract

A predatory Lepidoptera that has the potential to be a biological control agents of the soft scale insect (Coccidae) on coffee plants (Coffea spp.) was found in Sukabumi, West Java. However, information regarding the species name of predatory Lepidoptera has never been reported in Indonesia. Literature for morphological identification of this predatory Lepidoptera species is limited. Therefore, this study was conducted to identify predator species molecularly. Predators were collected from coffee plantations that were infested by soft scale in Sukabumi, West Java. Identification using the PCR procedures of mitochondrial COI gene was carried out in the laboratory. The results show that the sample DNA sequences (629 bp) has a similarity level of 95.67% (GenBank) and 95.37% (BOLD Systems) to the Autoba rubra Hampson species. Based on phylogeny analysis, the sample is also closely related to Mataeomera spp. The DNA sequences alignment variation of sample and four species voucher A. rubra in the GenBank database was 7.58%. Therefore, it can be concluded that the predatory Lepidoptera preying on soft scale insects on coffee plants in Sukabumi are most closely related to A. rubra.

PENDAHULUAN

Kututempurung (Coccidae), menurut (Waller et al., 2007) merupakan salah satu organisme pengganggu tanaman (OPT) yang sering ditemukan pada pertanaman kopi di Indonesia. Secara global, kehilangan hasil (termasuk biaya pengendalian) akibat kututempurung diperkirakan US$ 5 juta per tahun (Rutherford & Phiri, 2006) Oleh karena itu, populasi kututempurung perlu dimonitor dan dikendalikan.

Sehubungan dengan pengendaliannya, kututempurung memiliki beberapa musuh alami dari golongan predator, parasitoid, dan cendawan yang berpengaruh terhadap dinamika populasinya (Rosado et al., 2014)(Mani et al., 2008) Predator kututempurung yang banyak dilaporkan dan diteliti merupakan kumbang predator dari Famili Coccinellidae, di antaranya Azya luteipes Mulsant (Nais & Busoli, 2012) Diomus lupusapudoves Vandenberg (Iverson et al., 2022) dan Chilocorus politus Mulsant (Santosa et al., 2006) Berbeda dengan sebelumnya, predator kututempurung pada penelitian ini merupakan larva Lepidoptera yang imagonya berupa ngengat.

Pada bulan Oktober 2021, telah ditemukan larva predator pada pertanaman kopi di lingkungan kebun percobaan Balai Pengujian Standar Instrumen Tanaman Industri dan Penyegar (BPSI-TRI), Sukabumi, Jawa Barat. Berdasarkan pengamatan awal, predator diduga memiliki kemampuan pemangsaan yang cukup baik terhadap kututempurung. Populasi kututempurung terutama Coccus sp. yang pada saat itu melimpah, berkurang lebih dari setengah dalam waktu dua hari. Untuk mempelajari potensi pengendalian predator, diperlukan informasi penting di antaranya identitas taksonomi.

Di Lampung, ngengat predator dilaporkan memangsa kututempurung Coccus viridis (Green) (Hemiptera: Coccidae) pada tanaman kopi (Indriyati, 2015) Predator tersebut memiliki tingkat pemangsaan 97 ± 11 kutu/larva dalam waktu 6 hari di laboratorium. Larva predator di Lampung diidentifikasi sebagai Genus Eublemma melalui karakter morfologi menggunakan kunci identifikasi (Beardsley, 1982) Dalam catatan (Kalshoven, 1981) disebutkan bahwa beberapa spesies dari Genus Eublemma, bersama dengan Catoblemma dan Autoba, menjadi predator kututempurung di Indonesia. Ngengat predator di Sukabumi yang diamati sangat mirip secara tampilan luar dengan predator di Lampung, berdasarkan gambar yang tersedia. Namun demikian, untuk menentukan dan memastikan spesies predator secara morfologi masih terkendala oleh keterbatasan literatur.

Teknologi molekuler telah digunakan untuk identifikasi taksonomi serangga (Hoy, 2003) Dibanding morfologi, hasil yang diperoleh melalui metode molekuler lebih akurat (Oyston et al., 2022) Selain itu, metode molekuler memiliki keunggulan, di antaranya dapat digunakan untuk genom yang tidak diketahui, efisien, dan sangat sensitif karena mampu mendeteksi variasi intra spesies (Hadrys et al., 1992)(Parle-McDermott & RO, 2021) Identifikasi secara molekuler untuk spesies predator ini belum pernah dilakukan sebelumnya di Indonesia. Oleh karena itu, penelitian bertujuan untuk mengetahui spesies ngengat predator melalui identifikasi molekuler, sehubungan potensi pengendaliannya terhadap kututempurung pada tanaman kopi.

BAHAN DAN METODE

Predator diperoleh dari pertanaman kopi yang terserang kututempurung di kebun BPSI- TRI, Sukabumi, Jawa Barat (6° 50’ 42,29’’ LS, 106° 45’ 10,3’’ BT). Kegiatan sampling predator dilaksanakan pada bulan Desember 2022. Sampel berupa individu larva instar akhir predator sebanyak tiga sampel. Masing-masing sampel diambil menggunakan pinset, dimasukkan wadah plastik yang ditutup kain kasa dan diberi label. Identifikasi molekuler untuk mengetahui spesies predator dilakukan di Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, IPB University, Bogor, segera setelah sampel diambil dari lapangan. Identifikasi molekuler terhadap masing-masing sampel meliputi tahap ekstraksi DNA, amplifikasi dengan PCR, elektroforesis, visualisasi, sekuensing DNA dan analisis data. Imago dan larva predator yang digunakan untuk pengambilan gambar merupakan individu-individu hasil rearing di rumah kaca BPSI-TRI, Sukabumi, hingga bulan Februari 2023.

Ekstraksi DNA

Metode ekstraksi DNA merujuk pada (Doyle & Doyle, 1990) dengan modifikasi. Sampel DNA berasal dari larva segar utuh instar akhir predator yang telah dipisahkan dari penutup/cangkangnya. Ekstraksi diawali dengan menyiapkan larutan buffer 125 µl cetyl trimethylammonium bromide (CTAB) (2% CTAB; 1,4 M NaCI; 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl; pH 8,0) dan 1,25 µl 0,2% 2-mercaptoethanol, dalam tube plastik 1,5 ml. Larva dimasukkan di dalam larutan buffer dan digerus menggunakan mikropistil sampai benar- benar halus. Selanjutnya, dilakukan proses homogenisasi dengan vortex mixer selama 10 detik dan inkubasi pada suhu 65 °C di drybath selama 30 menit (setiap 10 menit sekali, di-vortex selama 10 detik). Larutan kemudian ditambahkan 125 µl kloroform-isoamil alkohol (CIAA) (24:1), dikocok manual selama 3 menit, diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 8.000 rpm selama 10 menit. Supernatan (lapisan teratas) yang terbentuk, dipindah ke tube baru menggunakan pipet sambil dicatat volumenya, kemudian ditambahkan CH₃COOKNa sebanyak 1/10 total volume supernatan dan juga isopropanol bersuhu -20 °C sebanyak 2/3 total volume. Tube ditutup, dimasukkan ke dalam botol kaca dan dituangi nitrogen cair hingga membeku, kemudian dibiarkan selama 30−45 menit hingga kembali pada suhu ruang. Larutan kemudian disentrifugasi pada 8.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, menyisakan pelet DNA (gumpalan kecil seperti awan) berwarna putih di dalam tube. Selanjutnya, pelet dibilas dengan cara menambahkan 500 µl etanol 80% dan disentrifugasi pada 8.000 rpm selama 2 menit. Setelah itu, cairan dibuang dan pelet dikeringkan dengan cara membalik tube di atas cawan petri yang dialasi tissue dan ditempatkan di bawah AC bersuhu 20 °C selama 1 jam. Pelet kemudian diresuspensi dengan menambahkan 30 µl larutan buffer TE (10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; pH 7,4), di-vortex selama 5 detik, dan diinkubasi pada suhu ruang selama 1 jam. Sampel DNA hasil ekstraksi (DNA template) kemudian disimpan di dalam freezer bersuhu -20 °C, sebelum proses selanjutnya.

Amplifikasi

Target amplifikasi DNA pada penelitian ini merupakan fragmen mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I (COI) 710 pb merujuk (Folmer et al., 1994) yang diperoleh dengan bantuan primer universal LCO1490 forward (urutan oligonukleotida 5’ – GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTGG – 3’) dan HCO2198 reverse (urutan oligonukleotida 5’ – TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA – 3’). Amplifikasi menggunakan mesin GeneAmp PCR System 9700, dengan pengaturan sebagai berikut: tahap pradenaturasi pada suhu 94 °C (5 menit) dan diikuti tahapan siklus, yang meliputi denaturasi pada suhu 94 °C (1 menit), annealing pada suhu 52 °C (30 detik) dan pemanjangan pada suhu 72 °C (1 menit 30 detik), sebanyak 35 siklus, dilanjutkan tahap pasca-pemanjangan pada suhu 72 °C (10 menit) dan diakhiri proses pendinginan hingga suhu 4 °C. Dalam proses amplifikasi, digunakan sampel PCR dengan volume 25 µl, terdiri dari: 12,5 µl DreamTag Green PCR Master Mix; 1 µl primer forward; 1 µl primer reverse; 1,5 µl MgCl2; 8 µl ddH₂O; dan 1 µl DNA template.

Elektroforesis dan visualisasi

Hasil amplifikasi (PCR) dilanjutkan dengan proses elektroforesis dan divisualisasi untuk mengetahui keberhasilannya. Media yang digunakan, yaitu gel agarosa 1% dalam 1×TBE buffer (80 mM Tris-borat, 1 mM EDTA). Pertama, disiapkan cetakan gel dan dipasang sisir kecil (untuk enam lubang). Selanjutnya 0,2 g bubuk agarosa ditimbang, dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer, ditambahkan 20 ml TBE, dan dilarutkan dengan cara dioven pada suhu medium selama 80 detik. Larutan kemudian didiamkan pada suhu ruang hingga hangat, ditambahkan pewarna FluoroVue™ Nucleic Acid Gel Stain (10,000X) sebanyak 2 µl, dikocok manual, dituang ke dalam cetakan, dan dibiarkan mengeras pada suhu ruang ± 1 jam hingga menjadi gel. Gel kemudian dipindah ke mesin elektroforesis, yang sudah berisi larutan TBE. Sampel DNA hasil PCR dan marker 100 pb Plus DNA Ladder sebagai pembanding fragmen DNA, dimasukkan ke masing-masing lubang gel sebanyak 5 µl menggunakan pipet. Mesin elektroforesis dinyalakan dengan pengaturan 50 v selama 50 menit. Setelah proses elektroforesis selesai, gel divisualisasi menggunakan UV transilluminator dan hasilnya didokumentasikan.

Sekuensing DNA

Sekuensing DNA dilakukan oleh pihak ketiga. Sampel DNA yang berhasil teramplifikasi (produk PCR) dikirim sebanyak 20 µl, beserta primer forward dan primer reverse, masing-masing minimal 10 µl per sampel. Hasil sekuensing diterima dalam bentuk file AB1 forward dan reverse.

Analisis data

Hasil sekuensing forward dan reverse diedit dan digabungkan (di-contig) menggunakan aplikasi BioEdit version 7.2.5, kemudian dibandingkan dengan database spesies yang ada di GenBank National Center for Biotechnology Information (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) menggunakan basic local aligment search tool (BLAST). Sekuens DNA sampel juga dicocokkan dengan data spesies di BOLD Systems (https://www.boldsystems.org) menggunakan identification engine. Pencocokan data di GenBank dan BOLD System menghasilkan nilai homologi. Penjajaran sekuens DNA menggunakan metode ClustalW dengan aplikasi MEGA11, sedangkan jarak genetik dihitung secara berpasangan (pairwise) dengan metode maximum composite likelihood menggunakan aplikasi MEGA11. Pohon filogeni dibuat dengan aplikasi MEGA11 dengan metode maximum likelihood.

HASIL

Amplifikasi dan visualisasi DNA sampel predator

Pada visualisasi hasil amplifikasi (PCR) DNA, kolom pertama adalah marker, sedangkan kolom kedua merupakan pita DNA sampel ngengat predator Gambar 1. Dengan membandingkan posisi pita DNA sampel terhadap marker, diperkirakan bahwa panjang fragmen DNA sampel ±700 pb. Panjang fragmen tersebut sesuai dengan target yang diharapkan. Pita DNA sampel terlihat cukup tebal dan terang, yang berarti bahwa produk PCR yang dihasilkan dengan primer universal LCO-HCO mengandung cukup DNA untuk dilakukan sekuensing.

Sekuens DNA sampel predator

Berdasarkan pengolahan data sekuensing menggunakan Bioedit dan BLAST, diperoleh sekuens DNA ngengat predator yang berasal dari gen COI mitokondria dengan panjang fragmen 629 pb Ketiga sampel yang digunakan dalam penelitian ini memiliki sekuens DNA yang identik.

Gambar 1.Visualisasi amplifikasi DNA yang dihasilkan dengan primer LCO-HCO pada media gel agarose menggunakan UV-transilluminator setelah proses elektroforesis. 1: marker; 2: ngengat predator.(Visualization of DNA amplification using LCO-HCO primers after gel electrophoresis. 1: marker; 2: predatory Lepidoptera.)

Homologi dan filogeni antara sampel predator dengan 10 spesies paling mirip

Hasil pencocokan sekuens DNA sampel dengan voucher spesies pada database GenBank menunjukkan bahwa sampel memiliki nilai homologi paling tinggi dengan Autoba rubra Hampson voucher 10ANIC-06779, yaitu sebesar 95,67% Tabel 1. Sementara, pada BOLD Systems, diperoleh persentase kemiripan DNA sampel tertinggi dengan spesies A. rubra sebesar 95,37% Tabel 2. Pohon filogeni yang terbentuk menggambarkan dua kelompok besar yang terpisah, yaitu Mataeomera spp. dan A. rubra Gambar 3. Untuk Mataeomera, spesies yang berkerabat dekat dengan sampel terdiri atas M. mesotaenia (Turner), M. porphyris (Turner), M. coccophaga (Meyrick), dan M. dubia Butler.

Gambar 2.Sekuens DNA sampel ngengat predator (629 pb). Sekuens dari ketiga sampel identik.(The DNA sequences of predatory lepidoptera sample (629 bp). The three of samples have identical sequences)

Homologi dan filogeni antara sampel predator dan Autoba spp.

Bila dibandingkan dengan A. rubra dan Autoba sp. lain di GenBank, sekuens DNA sampel memperlihatkan nilai homologi dalam rentang 88,69–95,67%Tabel 3. Mayoritas Autoba spp. berasal dari Australia (Western Australia, Queensland dan Northern Territory), kecuali A. silicula Swinhoe voucher A. silicula Kothia yang berasal dari India Tabel 3. Wilayah negara atau negara bagian tersebut, secara geografis dekat dengan Indonesia. Hasil konstruksi filogeni antar spesies Autoba memperlihatkan bahwa sampel ngengat predator dan A. rubra merupakan sister group Gambar 4. Hal ini didukung dengan data jarak genetik. Sampel memiliki jarak genetik paling kecil dengan A. rubra sebesar 4,5%, dan selanjutnya dengan A. dispar Warren sebesar 7,3% Tabel 4. Semakin kecil jarak genetik, semakin dekat hubungan kekerabatannya.

Tabel 1.Sepuluh besar voucher spesies di database GenBank yang sekuens DNA-nya paling identik dengan sampel ngengat predator per 25 Juni 2024(Top ten of species voucher DNA sequences in the GenBank database that most identical to the predatory lepidoptera sample per June 25, 2024)

Voucher spesies (Species voucher)	Max/Total score	Query cover (%)	Percent identity (%)
Autoba rubra voucher 10ANIC-06779	1003	99	95,67
Autoba rubra voucher 10ANIC-06777	985	100	94,91
Mataeomera mesotaenia voucher 10ANIC-06800	959	99	94,39
Mataeomera porphyris voucher 10ANIC-06811	959	99	94,39
Mataeomera coccophaga voucher 10ANIC-06805	953	99	94,23
Mataeomera coccophaga voucher 10ANIC-06803	953	99	94,23
Autoba rubra voucher 10ANIC-06780	953	96	94,91
Mataeomera porphyris voucher 10ANIC-06806	953	99	94,23
Mataeomera dubia voucher 10ANIC-06814	950	98	94,21
Autoba rubra voucher 10ANIC-06778	942	95	95,00

Tabel 2.Sepuluh besar sekuens DNA di BOLD Systems yang paling mirip dengan sampel ngengat predator per 25 Juni 2024(Top ten of DNA sequences in the BOLD Systems that most similar to the predatory Lepidoptera sample per June 25, 2024)

Ordo (Order)	Famili (Family)	Genus	Spesies (Species)	Similarity (%)
Lepidoptera	Erebidae	Autoba	Autoba rubra	95,37
Lepidoptera	Erebidae	Autoba	Autoba rubra	94,90
Lepidoptera	Erebidae	Autoba	Autoba rubra	94,90
Lepidoptera	Erebidae	Autoba	Autoba rubra	94,88
Lepidoptera	Noctuidae	Mataeomera	Mataeomera coccophaga	94,83
Lepidoptera	Erebidae	Autoba	Autoba rubra	94,74
Lepidoptera	Erebidae	Autoba	Autoba rubra	94,74
Lepidoptera	Erebidae	Autoba	Autoba rubra	94,69
Lepidoptera	Noctuidae	Mataeomera	Mataeomera dubia	94,42
Lepidoptera	Noctuidae	Mataeomera	Mataeomera dubia	94,39

Gambar 3.Pohon filogeni sampel ngengat predator dan sepuluh voucher spesies paling mirip di database GenBank dengan metode maximum likelihood (Chilocorus politus sebagai outgroup).(Phylogeny tree of the predatory lepidoptera sample and top 10 species voucher in the GenBank database using Maximum Likelihood method (Chilocorus politus as outgroup).)

Tabel 3.Homologi sekuens DNA antara sampel ngengat predator dan Autoba spp. yang ada di GenBank per 25 Juni 2024(Homology of DNA sequences between the predatory lepidoptera sample and Autoba spp. in the GenBank per June 25, 2024)

Spesies (Species)	Max/ Total score	Query cover (%)	Percent Identity (%)	Lokasi/ (Location)
Autoba rubra voucher 10ANIC-06779	1003	99	95,67	Western Australia
Autoba rubra voucher 10ANIC-06777	985	100	94,91	Queensland
Autoba rubra voucher 10ANIC-06780	953	96	94,91	Queensland
Autoba rubra voucher 10ANIC-06778	942	95	95,00	Queensland
Autoba dispar voucher 10ANIC-06790	935	100	93,49	Western Australia
Autoba latericolor voucher 10ANIC-06776	893	99	92,47	Queensland
Autoba quadrapex voucher 10ANIC-06797	859	97	91,87	Queensland
Autoba silicula voucher 10ANIC-06770	841	100	90,79	Northern Territory
Autoba versicolor voucher 10ANIC-06773	832	98	90,82	Queensland
Autoba pectorora voucher 10ANIC-06766	821	99	90,38	Northern Territory
Autoba silicula voucher Autoba silicula Kothia	804	99	89,90	India
Autoba abrupta voucher 10ANIC-06783	787	97	89,77	Queensland
Autoba crassiuscula voucher 10ANIC-06785	769	100	88,73	Queensland
Autoba undilinea voucher 10ANIC-06767	754	98	88,69	Queensland

Gambar 4.Pohon filogeni sampel ngengat predator dan Autoba spp. di database GenBank dengan metode maximum likelihood (Chilocorus politus sebagai outgroup).(Phylogeny tree of the predatory lepidoptera sample and Autoba spp. in the GenBank database using maximum likelihood method (Chilocorus politus as outgroup).)

Variasi DNA antara sampel predator dan spesies A. rubra

Hasil penjajaran sekuens DNA antara sampel dan empat voucher spesies A. rubra di GenBank menunjukkan bahwa kelima taksa memiliki 594 daerah lestari dan terdapat variasi sekuens basa nukleotida di beberapa lokasi. Variasi nukleotida antar kelima taksa meliputi 45 daerah nukleotida berbeda atau sebesar 7,58%, sedangkan variasi nukleotida di antara keempat A. rubra (tanpa sampel) sebesar 4,88% atau ada 29 daerah nukleotida berbeda Tabel 5. Hal ini menunjukkan bahwa variasi DNA sampel dengan A. rubra lebih tinggi dibandingkan dengan variasi intraspesies A. rubra yang sebelumnya ada di GenBank.

Imago dan larva predator

Predator yang dipelihara pada penelitian ini mengalami tahap perkembangan metamorfosis sempurna, yaitu dari larva, pupa hingga imago. Larva predator berupa ulat berbentuk eruciform. Larva instar akhir berwarna merah muda Gambar 5. Spirakel abdomen ruas ke-8 dan 7 berada di posisi sejajar secara lateral dan berukuran sama. Larva tertutup oleh semacam kubah bulat sehingga hanya bagian abdomen yang tidak tertutup. Penutup larva berwarna coklat terbuat dari sisa-sisa tempurung kutu yang dimangsa dan bahan organik lain, seperti jaringan tanaman dan embun jelaga, yang dipintal dengan benang sutera. Demikian pula pupanya terlindung di dalam penutup. Pupa berbentuk obtekta berwarna kuning kecokelatan, sedangkan penutup pupa berbentuk oblong dan berwarna cokelat.Imago predator merupakan ngengat berwarna cokelat dengan lebar sayap berukuran 1,66 ± 0,11 cm (n = 10) Gambar 6. Posisi ujung abdomen tidak melebihi sayap belakang. Sayap depan, sayap belakang, dan abdomen masing-masing ditampilkan pada Gambar 7. Di bagian tepi sayap depan terdapat pola seperti garis melengkung. Baik pada sayap depan maupun sayap belakang, ada garis melintang di tengah sayap dan titik- titik berwarna hitam di bagian mendekati ujung sayap. Segmen pada abdomen berwarna putih. Tipe antena filiform dan alat mulut imago berupa palpus labial.

Tabel 4.Matriks jarak genetik antara sampel ngengat predator dengan Autoba spp. yang ada di GenBank(Genetic distance matrix of the predatory Lepidoptera sample and Autoba spp. in the GenBank)

		[1]	[2]	[3]	[4]	[5]	[6]	[7]	[8]	[9]	[10]	[11]
sampel	[1]
Autoba rubra voucher 10ANIC-06779	[2]	0,045
Autoba quadrapex voucher 10ANIC-06797	[3]	0,091	0,086
Autoba silicula voucher Autoba silicula Kothia	[4]	0,112	0,113	0,099
Autoba dispar voucher 10ANIC-06790	[5]	0,073	0,087	0,085	0,102
Autoba crassiuscula voucher 10ANIC-06785	[6]	0,127	0,135	0,122	0,128	0,103
Autoba abrupta voucher 10ANIC-06783	[7]	0,118	0,115	0,092	0,135	0,102	0,141
Autoba latericolor voucher 10ANIC-06776	[8]	0,081	0,086	0,070	0,109	0,081	0,120	0,088
Autoba versicolor voucher 10ANIC-06773	[9]	0,100	0,113	0,088	0,110	0,089	0,120	0,111	0,084
Autoba undilinea voucher 10ANIC-06767	[10]	0,129	0,136	0,111	0,150	0,115	0,156	0,031	0,105	0,121
Autoba pectorora voucher 10ANIC-06766	[11]	0,106	0,107	0,081	0,126	0,105	0,116	0,111	0,101	0,080	0,120
Autoba silicula voucher 10ANIC-06770	[12]	0,100	0,099	0,071	0,083	0,081	0,108	0,101	0,077	0,043	0,120	0,082

Tabel 5.Variasi sekuens DNA sampel ngengat predator dengan Autoba rubra yang ada di GenBank(DNA sequence variations of the predatory Lepidoptera sample and Autoba rubra in the GenBank)

Image

Gambar 5.Larva predator yang memangsa kututempurung pada kopi di Sukabumi, Indonesia. A: spirakel abdomen ruas ke-7; B: spirakel abdomen ruas ke-8.(The predatory Lepidoptera larvae that preys on scale insects on coffee in Sukabumi, Indonesia. A: seventh abdominal spiracle; B: eighth abdominal spiracle.)

Gambar 6.Imago ngengat predator yang memangsa kututempurung pada kopi di Sukabumi, Indonesia.(The predatory Lepidoptera adult that preys on scale insects on coffee in Sukabumi, Indonesia.)

PEMBAHASAN

Dalam penelitian ini, analisis DNA menunjukkan bahwa sampel ngengat predator memiliki homologi dengan spesies A. rubra sebesar 95,67% (GenBank) dan 95,37% (BOLD). Serangga (studi kasus Subfamili Scarabaeinae) dapat dinyatakan identik (similar) pada tingkat spesies jika persentase kecocokan DNA-nya berdasarkan fragmen gen COI mitokondria bernilai lebih dari 93,4%(Baena-Bejarano et al., 2023) Variasi DNA antara sampel dengan A. rubra sebesar 7,58%, sedangkan variasi intraspesies A. rubra di database GenBank sebesar 4,88%. Meskipun menurut (Hebert et al., 2004) ambang batas variasi COI intraspesies untuk burung, yaitu 2,7%, lebih kecil dibandingkan dengan hasil penelitian ini, namun kelompok burung mungkin berbeda dengan serangga. Apabila mengacu pada pernyataan(Baena-Bejarano et al., 2023) maka dapat diduga bahwa sampel merupakan spesies A. rubra. Ngengat predator dari Genus Autoba, diketahui merupakan salah satu musuh alami kututempurung di Indonesia, selain Catoblemma dan Eublemma(Kalshoven, 1981)

Terdapat empat voucher spesies A. rubra yang ada di GenBank dan semua ditemukan di Australia. Dari sisi geografis, Australia dan Indonesia cukup dekat sehingga dimungkinkan memiliki serangga sejenis. Sejarah filogeni DNA terstruktur secara geografis dan terkait secara erat telah terbukti pada banyak spesies(Avise et al., 1987) Di sisi lain, variasi DNA antara sampel ngengat predator dan spesies A. rubra lebih tinggi dibandingkan dengan variasi DNA intraspesies A. rubra yang berasal dari Australia. Perbedaan sumber daya antar habitat lokal dapat memengaruhi struktur geografis populasi serangga(Roderick, 1996)

Gambar 7.Sayap depan (A), sayap belakang (B), dan abdomen (C) imago ngengat predator.(Fore wing (A), hind wing (B), and abdomen (C) of the predatory lepidoptera imago.)

Studi yang dilakukan oleh (Indriyati, 2015) menunjukkan bahwa ngengat predator yang memangsa C. viridis di Lampung termasuk Genus Eublemma berdasarkan ciri morfologi larva. Pada pengamatan yang dilakukan, sampel ngengat predator di Sukabumi dan ngengat predator di Lampung sangat mirip bentuk dan warna, baik larva, pupa maupun imagonya. Namun demikian, hasil analisis DNA tidak cukup mendukung bahwa sampel ngengat predator berkerabat dekat dengan Eublemma. Pohon filogeni menunjukkan bahwa sampel berkerabat lebih dekat dengan A. rubra dan Mataeomera spp. Dalam penelitian(Ovalle et al., 2014) analisis filogenetik merupakan alat yang akurat dan efektif untuk mengelompokkan spesies kutukebul dan membandingkan antara karakter molekuler dengan morfologinya.(Beardsley, 1982) membuat kunci identifikasi untuk larva instar akhir yang membedakan Genus Eublemma dan Amyna. Salah satunya, yaitu melalui rasio tinggi spirakel abdomen ruas ke- 8:7. Untuk Eublemma, rasio tinggi spirakel ke-8 kurang dari dua kali tinggi spirakel ke-7 (8:5), sedangkan untuk Amyna, rasio tinggi spirakel ke-8 lebih dari dua kali tinggi spirakel ke-7 (12:5). Pada kenyataannya, larva ngengat predator di Lampung memiliki spirakel ke-8 dan ke-7 yang hampir sama baik tinggi maupun ukurannya(Indriyati, 2015) demikian juga tampilan spirakel ke-8 dan ke-7 larva ngengat predator di Sukabumi.Ngengat A. rubra(Hampson, 1902) pada mulanya didefinisikan sebagai E. rubra(Hampson, 1902) Imago E. rubra pertama kali dideskripsikan oleh(Hampson, 1902)(Hampson, 1902)A. rubra(Poole, 1989) E. rubra, menurut(Hampson, 1902) berhabitat di Sikhim (India), Singapura, dan Jawa (Indonesia). Secara taksonomi, Autoba dan Eublema dikelompokkan dalam famili yang sama, yaitu Erebidae. Famili Erebidae dipisahkan dari Famili Noctuidae pada tahun 1990-an, didukung oleh hasil penelitian molekuler. Autoba masuk dalam Subfamili Boletobiinae, sedangkan Eublemma termasuk Subfamili Eublemminae(Abdelfattah, 2021) Hampir semua larva Lepidoptera (99%) merupakan fitofag atau memakan tanaman(Strong et al., 1984)(Common, 1990) sedangkan sisanya atau sebagian kecil berperan sebagai predator dan parasitoid(Pierce, 1995) Seperti Lepidoptera lainnya, terdapat beberapa Spesies Autoba yang fitofag dan menjadi hama, di antaranya A. silicula(Ramaiah et al., 2023) A. abrupta Walker dan A. versicolor Walker(Dean, 1978) Khusus untuk Genus Autoba predator, belum banyak literatur yang tersedia. Di Thailand, terdapat dua Spesies Autoba yang menjadi predator Coccoidea pada tanaman buah-buahan, yaitu A. rubra dan A. coccidiphaga. Ngengat A. rubra merupakan predator kutu Kerria lacca (Kerr) (Hemiptera: Kerriidae), sedangkan A. coccidiphaga merupakan predator Xenolecanium mangiferae Takahashi (Hemiptera: Coccidae), Ceroplastes rubens Maskell (Hemiptera: Coccidae), Saissetia nigra King (Hemiptera: Coccidae) dan Tachardiella decorella Maskell (Hemiptera: Kerriidae)(Charensom et al., 1980) Demikian juga dengan ngengat E. rubra, informasi yang diketahui mengenai predator ini masih terbatas. Menurut(Pierce, 1995) E. rubra merupakan predator obligat terhadap Coccus optimum (Hemiptera: Coccidae) dan C. africanus Newstead (Hemiptera: Coccidae). Selain genus Autoba, sampel predator juga berkerabat dengan Genus Mataeomera. Serangga M. dubia merupakan predator Saissetia oleae (Olivier) (Hemiptera: Coccidae) pada jeruk(Dao et al., 2013) di Australia dan Parthenolecanium persicae (Fabricius) (Hemiptera: Coccidae) pada anggur di Australia(Rakimov et al., 2015) Ngengat M. dubia sejenis dengan Spesies Catoblemma yang ada di Australia dan kedua genus tersebut dinyatakan sinonim(Edwards, 1996) Ngengat A. rubra yang merupakan sinonim E. rubra(Poole, 1989) telah lama ada di Indonesia(Hampson, 1902) dan berperan sebagai predator kututempurung(Kalshoven, 1981)(Pierce, 1995) Namun demikian, pemanfaatan ngengat predator sebagai agens pengendali hayati kututempurung belum banyak diteliti, meskipun memiliki tingkat predasi yang cukup baik, 97 ± 11 kutu/larva(Indriyati, 2015) Oleh karena itu, untuk mengetahui potensi ngengat predator sebagai agens pengendali hayati di lapangan, diperlukan studi lebih lanjut mengenai biologi, ekologi, distribusi, tingkat pengendalian, dan cara perbanyakan. Selain itu, identifikasi secara morfologi secara lebih lengkap juga perlu dilakukan untuk melengkapi informasi DNA.

KESIMPULAN

Hasil identifikasi secara molekuler menunjukkan bahwa ngengat predator yang memangsa kututempurung (Coccidae) pada pertanaman kopi (Coffea spp.) di Sukabumi memiliki kemiripan paling dekat dengan spesies A. rubra berdasarkan sekuens DNA dengan tingkat homologi sebesar 95,67%.

References

1. Abdelfattah Salem M.A.. Revision of Lepidoptera of Egypt Superfamily Noctuoidea. Egyptian Academic Journal of Biological Sciences. A. Entomology. 2021; 14:59-142. DOI
2. Avise J.C., Arnold J., Ball R.M., Bermingham E., Lamb T., Neigel J.E., Reeb C.A., Saunders N.C.. Intraspecific phylogeography: The mitochondrial DNA bridge between population genetics and systematics. Annual Review of Ecology and Systematics. 1987; 18:489-522. DOI
3. Baena-Bejarano N., Reina C., Martinez-Revelo D.E., Medina C.A., Tovae E., Uribe-Soto S., Nelta-Moreno J.C., Gonzales M.A.. Taxonomic identification accuracy from BOLD and GenBank databases using over a thousand insect DNA barcodes from Colombia. Plos One. 2023; 18:e0277379DOI
4. Beardsley J.W.. A key to the late instar larvae of some Hawaiian Noctuidae. Proceedings Hawaiian Entomological Society. 1982; 24:37-49.
5. Parle-McDermott Cassedy A.A., RO Kennedy. Virus detection: A review of the current and emerging molecular and immunological methods. Frontiers in Molecular Biosciences. 2021; 8(637559)DOI
6. Charensom K., Napompeth B., Suasaard W.. Predatory caterpillars of scale insects on fruit trees in Thailand. Research Reports. 1980.
7. Common I.F.B.. E. J. Brill: Leiden, New York, Kopenhagen & Koln; 1990. Publisher Full Text | DOI
8. Dao H.T., Meats A., Beattie G.A.C., Spooner-Hart R.. Ant-coccid mutualism in citrus canopies and its effect on natural enemies of red scale, Aonidiella aurantii (Maskell) (Hemiptera: Diaspididae. Bulletin of Entomological Research. 2013; 104:137-42. DOI
9. Dean G.J.. Insects found on economic plants other than rice in Laos. International Journal of Pest Management. 1978; 24:129-142. DOI
10. Doyle J.J., Doyle J.L.. A rapid total DNA preparation procedure for fresh plant tissue. Focus. 1990; 12:13-15.
11. Edwards E.D.. Checklist of the Lepidoptera of Australia. CSIRO: CSIRO; 1996:291-333.
12. Folmer O., Black M., Hoeh W., Lutz R., Vrijenhoek R.. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Molecular Marine Biology and Biotechnology. 1994; 3:294-299.
13. Hadrys H., Balick M., Schierwater B.. Applications of random amplified polymorphic DNA (RAPD) in molecular ecology. Molecular Ecology. 1992; 1:55-63. DOI
14. Hampson G.F.. The Moths of India. Supplement paper to the volumes in “The Fauna of British India. Series II. Part VI. Journal of the Bombay Natural History Society. 1902; 14:197-219.
15. Hebert P.D.N., Stoeckle M.Y., Zemlak T.S., Francis C.M.. Identification of birds through DNA barcodes. Plos Biology. 2004; 2:e312DOI
16. Hoy M.A.. Academic Press: San Diego, Burlington & London; 2003.
17. Indriyati Susilo F.X.. Preliminary study on Eublemma sp. (Eublemminae): A lepidopteran predator of Coccus viridis (Hemiptera: Coccidae) on coffee plants in Bandar Lampung, Indonesia. Jurnal Hama dan Penyakit Tumbuhan Tropika. 2015; 15:10-16. DOI
18. Iverson A., Burnham R., Perfecto I., Vandenberg N., Vandermeer J.. A tropical lady beetle, Diomus lupusapudoves (Coccinellidae), deceives potential enemies to predate an ant-protected coffee pest through putative chemical mimicry. International Journal of Tropical Insect Science. 2022; 42:947-953. DOI
19. Kalshoven L.G.E.. PT Ichtiar Baru – van Hoeve: Jakarta; 1981.
20. Mani M., Visalakshy P.N.G., Krishnamoorthy A., Venugopalan R.. Role of Coccophagus sp. in the suppression of the soft green scale Coccus viridis (Green. 2008. DOI
21. Nais J., Busoli A.C.. Morphological, behavioral and biological aspects of Azya luteipes Mulsant fed on Coccus viridis (Green. Scientia Agricola. 2012; 69:81-83. DOI
22. Ovalle T.M., Parsa S., Hernandez M.P., Becerra Lopez-Lavalle L.A.. Reliable molecular identification of nine tropical whitefly species. Ecology and Evolution. 2014; 4:3778-3787. DOI
23. Oyston J.W., Wilkinson M., Ruta M., Wills M.A.. Molecular phylogenies map to biogeography better than morphological ones. Communication Biology. 2022; 5(521)DOI
24. Pierce N.E.. Predatory and parasitic Lepidoptera: carnivores living on plants. Journal of The Lepidopterists’ Society. 1995; 49:412-453.
25. Poole R.W.. E. J. Brill/ Flora & Fauna Publications: Leiden, New York, Kopenhagen & Koln; 1989.
26. Rakimov A., Hoffmann A.A., Malipatil M.B.. Natural enemies of soft scale insects (Hemiptera: Coccoidea: Coccidae) in Australian vineyards. Australian Journal of Grape and Wine Research. 2015; 21:302-310. DOI
27. Ramaiah M., Naik S., Meshram N.M., Bhagyashree S.N., Shashank P.R.. First host report of earhead worm Autoba silicula (Swinhoe 1897) on maize. Indian Journal of Entomology. 2023; 86:187-191. DOI
28. Roderick G.K.. Geographic structure of insect populations: Gene flow, phylogeography, and their uses. Annual Review of Entomology. 1996; 41:325-52. DOI
29. Rosado J.F., Bacci L., Martins J.C., Silva G.A., Gontijo L.M., Picanco M.C.. Natural biological control of green scale (Hemiptera: Coccidae): a field life-table study. Biocontrol Science and Technology. 2014; 24:190-202. DOI
30. Rutherford M.A., Phiri N.. CABI: Wallingford; 2006.
31. Santosa B., Wagiman F.X., Martono E.. Pertumbuhan dan perkembangan kumbang buas Chilocorus politus pada kutu Coccus viridis. Agrosains. 2006; 19:13-20.
32. Strong D.R., Lawton J.H., Southwood T.R.E.. Blackwell Scientific: Oxford; 1984.
33. Waller Bigger, M Hillocks, R.J.. Coffee Pests, Diseases, and Their Management. 2007. DOI