Penyakit demam dengue (DD) merupakan penyakit endemik di wilayah tropis dan subtropis. Pengembangan strategi baru dengan memanfaatkan teknologi terkini telah dilakukan untuk mengendalikan transmisi virus dengue, yaitu pemanfaatan bakteri endosimbiotik Wolbachia (Saraswati et al., 2023). Potensi penerapan bakteri simbiosis Wolbachia merupakan upaya untuk pengendalian penyakit dengue melalui penyebaran vektor dengan senjata alami (Iturbe-Ormaetxe et al., 2011). Bakteri ini secara alami ditemukan pada 50% spesies arthropoda, isopoda, serta nematoda dan dinyatakan aman untuk manusia, hewan, dan lingkungan sekitarnya (Zhou & Li, 2016); (Werren et al., 2008). Pengembangan strategi pengendalian DD telah dilakukan dengan memanfaatkan bakteri endosimbiotik Wolbachia yang diinfeksikan ke nyamuk Aedes aegypti (Linnaeus) (Walker et al., 2011); (Buchori et al., 2022); (Ye et al., 2015). Inovasi teknologi Wolbachia terbukti efektif di 14 negara serta telah diakui oleh WHO sebagai teknologi pengendalian vektor dengue (Buchori et al., 2022). Sementara di Indonesia efektifitas teknologi Wolbachia ini terbukti menurunkan kasus dengue 77% dan penurunan pasien rawat inap sebanyak 86% di Yogyakarta (Buchori et al., 2022).

Dampak kehadiran Wolbachia di dalam tubuh nyamuk A. aegypti berakibat pada perubahan tingkah laku nyamuk betina dalam menghisap darah sehingga menyebabkan ketidaknormalan reproduksi dan berdampak pada kelangsungan hidup telur dan larva nyamuk (Irfandi, 2018); (McMeniman & O’Neill, 2010); (Crain et al., 2011). Dampak yang perlu diperhatikan juga adalah adanya ketidakmampuan nyamuk dalam bertahan hidup di alam liar yang akan menyebabkan proses pelepasan nyamuk Wolbachia oleh pemerintah harus disokong secara terus menerus (Irfandi, 2018). Kajian genetik perlu dilakukan mengingat kemampuan nyamuk Wolbachia di alam belum banyak diketahui dari aspek genetik. Gen neurotranscriptome penyandi ovary ecdysteroidogenic hormone (OEH) merupakan gen yang dapat dijadikan acuan studi genetik nyamuk untuk mengetahui perubahan prilaku nyamuk betina, seperti perkawinan dan kemampuan mengkonsumsi darah serta merupakan area studi intensif bagi pengendalian vektor (Matthews et al., 2016). Hormon ini dilepaskan oleh otak pada saat nyamuk betina mengkonsumsi darah sehingga merangsang pembentukan telur (Gulia-Nuss et al., 2015). Studi genetik ini merupakan studi pendahuluan untuk dapat membantu kajian dalam aspek pengendalian vektor DD.

Penelitian terdahulu telah dilakukan oleh beberapa ahli yang mengangkat studi atau kajian tentang nyamuk A. aegypti yang terinfeksi Wolbachia,yaitu dampak perubahan perilaku nyamuk serta perubahan fenotipe nyamuk (Iturbe-Ormaetxe et al., 2011); (Irfandi, 2018). Sementara kajian genetik telah banyak dilakukan pada nyamuk A. aegypti alami, seperti ditemukannya pengaruh steroidogenic neurohormone pada nyamuk betina dan ditemukannya sekuen penyandi OEH (Gulia-Nuss et al., 2015); (Brown et al., 1998). Hormon tersebut berpengaruh terhadap perilaku nyamuk betina dalam menghisap darah dan reproduksi telur. Namun, kajian genetik mengenai perubahan perilaku nyamuk A. aegypti yang terinfeksi Wolbachia masih tergolong baru khususnya yang berpanguh terhadap perubahan perilaku mengisap darah dan reproduksi nyamuk yang berkaitan dengan hormon OEH. Perancangan primer diperlukan sebagai penelitian pendahuluan mengenai studi genetik gen OEH serta menguji primer tersebut untuk mendapatkan kondisi optimal sehingga dapat menghasilkan produk PCR yang baik.

Metode polymerase chain reaction (PCR) merupakan metode yang umum digunakan untuk studi genetik. Metode PCR merupakan metode amplifikasi DNA secara enzimatis dengan bantuan enzim polimerase (Borah, 2011). Desain primer merupakan tahapan yang sangat krusial dalam studi genetik karena perancangan primer yang spesifik akan menentukan keberhasilan proses PCR (Deratih & Achyar, 2021). Uji in silico merupakan uji secara bioinformatika yang dapat diuji kebenarannya. Penelusuran secara in silico juga akan memudahkan para peneliti untuk mengetahui kemungkinan resiko yang akan didapatkan sebelum mulai pada penelitian in vitro. Oleh karena itu, uji in silico sangat penting untuk dilakukan terutama pada penelitian beresiko tinggi, seperti desain primer yang akan dilakukan dengan menggunakan metode PCR (Parikesit et al., 2017). Tujuan penelitian ini adalah melakukan rancangan primer gen OEH secara in silicodan mengetahui kondisi optimal primer yang dirancang untuk dapat menghasilkan amplifikasi pada daerah gen OEH secara in vitro.

Hasil penelusuran dengan GenBank ditemukan gen penyandi OEH memiliki panjang total sebesar 973 pb. Desain primer secara in silico pada daerah gen penyandi ovary ecdysteroidogenic hormone (OEH) dengan software NCBI, ditemukan sebanyak 10 pasang kandidat primer yang mengamplifikasi daerah gen OEH. Dua kandidat pasangan primer terbaik dilakukan pengujian secara in silico dengan melakukan uji kualitas primer dan in silico PCR dengan software FastPCR. Primer OEH8 dan primer OEH9 ditentukan menjadi kandidat primer untuk penyandi daerah gen OEH Table 1. Penentuan primer yang optimal memenuhi kriteria penentuan primer, yaitu mewakili lokasi amplifikasi pada wilayah target, panjang oligonukleotida primer yang ideal, nilai temperature melting (Tm), persentase nilai GC, dan kemungkinan kemunculan dimer antar primer (Septiasari, 2022).

Primer OEH8 merupakan pasangan primer yang terpilih karena memiliki lokasi penempelan pada basa ke 82 sampai basa ke 345 dari gen OEH, sedangkan primer OEH 9 memiliki lokasi ke 326 sampai 561. Maka,diperkirakan mewakili sebagian besar wilayah OEH yang memiliki total panjang 973 pb.

Proses amplifikasi memerlukan primer yang spesifik agar dapat menghasilkan produk PCR yang ideal. Jumlah nukleotida yang membentuk primer juga sangat berpengaruh terhadap proses amplifikasi. Menurut (Sasmitha et al., 2018), panjang primer berkisar 18–30 oligonukleotida. Jika kurang dari 18 oligonukleotida maka akan menyebabkan terjadinya penempelan primer pada tempat yang tidak spesifik, namun jika lebih dari 30 basa maka antar primer akan terjadi proses hibridasi dan akan menghambat terjadinya amplifikasi DNA (Sasmitha et al., 2018).

Nilai Tm adalah suhu saat untaian ganda DNA terpisah sebanyak 50%. Nilai Tm yang optimal berkisar 50–65oC,sedangkan selisih antar primer yang direkomendasikan paling banyak sekitar 5oC. Jika suhu Tm terlalu tinggi akan mempengaruhi proses amplifikasi DNA, namun jika terlalu rendah akan mengakibatkan munculnya unspecific product akibat dari penempelan primer pada sekuen yang tidak diinginkan (Pradnyaniti & Yowani, 2013).

Persentase jumlah G-C merupakan persentase banyaknya basa guanin dan sitosin pada primer. Persentase G-C yang optimal berada pada rentang 40–60%. Persentase G-C dapat mempengaruhi Tm suatu primer dan dapat mempengaruhi suhu pemisahan rantai ganda primer dan DNA template (Sasmitha et al., 2018). Sementara, primer dengan persentase G-C yang rendah dapat menurunkan efisiensi proses PCR (Borah, 2011) (Sasmito et al., 2014). Kemungkinan munculnya dimer antar primer juga mempengaruhi penentuan pasangan primer. Dimer pada ujung 3` primer sebaiknya tidak lebih dari 3 basa karena akan mempengaruhi spesifisitas dari primer (Pradnyaniti & Yowani, 2013).

Primer OEH9 memiliki kondisi optimal untuk menghasilkan amplifikasi pada konsentrasi primer 0,4 μM dengan suhu annealing 57oC. Kondisi ini ditentukan berdasarkan analisis tahapan elektroforesis menghasilkan pita DNA single band yang spesifik Table 3. Konsentrasi primer sangat menentukan keberhasilan proses amplifikasi karena konsentrasi yang optimal akan menghasilkan gambaran amplifikasi yang jelas dan spesifik. Konsentrasi primer yang terlalu rendah mengakibatkan proses amplifikasi tidak terjadi. Hal tersebut terjadi akibat tidak cukupnya kuantitas primer dalam menjalankan proses PCR, namun jika konsentrasi terlalu tinggi menyebabkan adanya template DNA belum teramplifikasi secara sempurna menyebabkan pita DNA yang tipis dan samar (Setyawati & Zubaidah, 2021).

Selain konsentrasi primer, suhu annealingmerupakan faktor penentu dari optimasi primer karena berpengaruh terhadap program PCR yang dapat menghasilkan hasil amplifikasi yang baik. Suhu annealing yang tinggi menyebabkan ikatan hidrogen antara basa nitrogen pada primer dan template DNA menjadi lemah sehingga primer tidak dapat menempel dengan kuat dan spesifik. Suhu annealing yang terlalu rendah juga dapat menyebabkan hasil amplifikasi tidak optimal karena primer akan menempel tidak hanya pada DNA target dan mengakibatkan hasil amplifikasi tidak spesifik (Sasmito et al., 2014).

Hasil optimasi primer OEH8 pada nyamuk A. aegypti wild type dan A. aegypti ber-Wolbachia Table 2 mendapatkan hasil yang berbeda, yaitu primer OEH8 pada sampel A. aegypti ber-Wolbachia menunjukkan adanya amplifikasi pada suhu rendah, yaitu 45 oC pada konsentrasi 0,4 μM. Berdasarkan uji in silico ukuran amplikon PCR pada primer OEH8 sekitar 264 pb,namun pada hasil eletroforesis menunjukkan ukuran panjang amplikon sebesar lebih dari 1000 pb sehingga diperkirakan gen yang teramplifikasi bukan gen OEH 8. Pada A.aegyptiwild type ditunjukkan hasil optimal pada proses PCR pada konsentrasi 0,4 μM dengan suhu annealing 47 oC, sedangkan pada sampel nyamuk A. aegypti ber-Wolbachia tidak mendapatkan produk amplifikasi. Dugaan sementara primer OEH8 dapat membedakan nyamuk A. aegyptiwild type dengan A. egypti ber-Wolbachia, tetapi pernyataan ini perlu dilakukan konfirmasi lebih lanjut dengan pendekatan analisis mutasi DNA pada A. aegypti ber-Wolbachia dengan teknik sekuensing.

Tahapan in silico merupakan tahapan yang dapat memprediksi minimalisisr kesalahan pada saat melakukan PCR secara in vitro (Parikesit et al., 2017). Pada penelitian ini, desain primer dan uji primer secara in silico dapat memprediksi ukuran produk DNA, lokasi penempelan primer, dan efisiensi PCR primer. Primer OEH8 dan OEH9 yang didesain telah memenuhi persyaratan uji primer. Namun, hanya primer OEH9 yang didesain ini dapat mengamplifikasi wilayah target dengan tepat sesuai yang telah dirancang secara in silico. Hal ini menunjukan bahwa primer OEH9 yang didesain sudah cukup baik untuk dapat digunakan dalam proses PCR dan dapat menghasilkan produk sesuai dengan rentang daerah yang diinginkan.

Desain primer yang spesifik pada daerah target gen penyandi ovary ecdysteroidogenic hormone (OEH), yaitu dengan nama primer OEH 8 dan OEH 9. Hasil uji in silico memperoleh ukuran produk DNA, yaitu 264 pb untuk primer OEH 8 dan 236 pb untuk primer OEH 9, serta efisiensi PCR kedua primer, yaitu 95%. Hasil uji secara in vitro menunjukkan hanya primer OEH 9 yang memenuhi kriteria primer sesuai uji in silico, yaitu konsentrasi primer 0,4 µM dengan suhu annealing 57 oC.