M. anisopliae diisolasi dari sampel tanah kebun kelapa sawit rakyat dengan kisaran umur 6–35 tahun. Sampel tanah diambil dari lima kabupaten di Provinsi Sumatera Utara, dari setiap kabupaten diambil tiga kecamatan dan masing- masing kecamatan diambil satu desa. Sampel tanah diambil di sekitar perakaran tanaman dengan menggunakan sekop kecil pada kedalaman 10–15 cm sebanyak ±100 g dari lima titik secara diagonal, kemudian dimasukkan ke dalam kantong plastik dan diberi label sesuai dengan lokasi pengambilan sampel dan waktu. Sampel tanah tersebut dibawa ke laboratorium dan diaduk hingga rata (dikompositkan). Pengambilan sampel tanah dari lima kabupaten Provinsi Sumatera Utara, yaitu Kabupaten Deli Serdang, Langkat, Simalungun, Labuhan Batu, dan Tapanuli Selatan yang merupakan sentra kelapa sawit rakyat (Sumut, 2016). Titik koordinat pengambilan sampel disajikan padaTabel 1.

Isolasi M. anisopliae dilakukan dengan memodifikasi metode umpan larva Tenebrio molitor Linnaeus yang dikemukakan oleh(Trizelia et al., 2013). Tanah sebanyak 300 g dimasukkan ke dalam kotak plastik berukuran tinggi 11 cm dan diameter 12 cm, kemudian 10 individu larva T. molitor instar 3 dimasukkan ke dalam kotak plastik yang telah berisi tanah tersebut dan diinkubasi pada suhu kamar selama 10–14 hari. Larva yang mati dengan gejala terinfeksi M. anisopliae diambil dan disterilisasi permukaan dengan natrium hipoklorit 1% dan dibilas tiga kali dengan air steril dan dikeringanginkan. Isolasi cendawan dilakukan dengan cara memotong tubuh larva dan mengambil bagian dalam tubuh larva dan diinokulasikan ke atas media sabouraud dextrose agar yeast (SDAY) steril dalam cawan petri. Cendawan yang tumbuh diidentifikasi secara makroskopis dan mikroskopis. Biakan murni M. anisopliae berumur 16 hari diambil dengan bor gabus ukuran 5 mm, lalu ditanamkan pada media SDAY dan diinkubasi selama 16 hari pada suhu 28 °C.

Morfologi M. anisopliae yang tumbuh pada cawan petri diamati dengan melihat warna koloni, bentuk konidia serta mengukur panjang dan lebar konidia di bawah mikoskop (data tidak disajikan).

Ekstraksi DNA dari konidia M. anisopliae menggunakan Wizard Genomic DNA Purification Kit. Cendawan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuse 1,5 ml berisi 200 µl protein nuclei lyses solution (NLS) lalu digerus menggunakan micro pestle hingga halus. Kemudian, ditambahkan lagi 400 µl protein NLS dan divorteks 1–3 detik untuk membasahi jaringan. Sampel diinkubasi dalam thermo mixer pada suhu 65 °C, 15 menit. RNase solution 3 µl ditambahkan ke lisat sel dan dicampur dengan membalikkan tabung 2–5 kali. Campuran tadi diinkubasi pada suhu 37 °C, 15 menit. Sampel dibiarkan dingin dalam suhu ruang selama 5 menit kemudian ditambahkan 200 µl protein precipitation solution dan divorteks 20 detik. Sampel disentrifugasi selama 3 menit pada 13.000 x g. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifuse 1,5 ml yang berisi 600 µl isopropanol suhu ruang. Larutan dicampur dengan perlahan dengan dibolak-balik. Larutan disentrifugasi pada 13.000 x g selama 4 menit. Supernatan dibuang dengan hati-hati. Kemudian, ditambahkan etanol 70% suhu ruang sebanyak 600 µl dan secara perlahan tabung dibalikkan beberapa kali untuk mencuci DNA. Selanjutnya, disentrifugasi pada 13.000 x g selama 1 menit. Etanol dibuang dan pelet DNA dikeringanginkan selama 15 menit. DNA rehydration solution ditambahkan sebanyak 100 µl dan rehidrasi pada suhu 65 °C selama 1 jam. DNA disimpan pada suhu 2–8 °C (Promega, 2019).

Identifikasi M. anisopliae secara molekuler dilakukan dengan sekuensing DNA menggunakan primer ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTTGCGG) untuk reaksi forward dan ITS4 (TCCTCCGCTT ATTGATATGC) untuk reaksi reverse sesuai yang dilakukan oleh (CC et al., 2012). Target pasangan basa yang harus dicapai di kisaran 600 pb. Proses thermocycler adalah sebagai berikut: Tahap 1: pra-amplifikasi PCR 3 menit pada suhu 95 °C; Tahap II: amplifikasi PCR dilakukan sebanyak 30 siklus reaksi, dengan pemisahan utas DNA genom (denaturasi) pada suhu 94 °C, 30 detik. Penempelan primer (annealing) pada suhu 55 °C, 30 detik: sintesis pada suhu 72 °C, 1 menit; dan tahap III: Pasca-amplifikasi pada suhu 72 °C, 10 menit. Sekuensing dilakukan untuk mengidentifikasi M. anisopliae dari ekstrak DNA. Ekstrak DNA dikirim ke Macrogen, Korea. Sekuens yang diperoleh dianalisis dengan data serupa yang telah dipublikasikan sebelumnya di bank gen dengan analisis penyejajaran (allignment). Analisis penyejajaran digunakan untuk membandingkan dua sekuens atau lebih dengan program Basic Local Allignment Search Tools (BLAST) melalui National Center Biotechnology Information (NCBI). Pohon filogenetik dibangun menggunakan perangkat lunak Mega 5.2. menggunakan algoritma NeighbourJoining Tree.

Hasil ekstraksi DNA diamplifikasi dengan teknik RAPD-PCR menggunakan 10 jenis primer, yaitu OPA-12 (TCGGCGATAG), OPA-09 (GGG TAACGCC), OPAB-04 (GGCACGCGTT), OPC- 04 (CCGCATCTAC), OPC-01 (TTCGAGCCAT), OPAB-09 (GGGCGACTAC), OPA-03 (AGTCAG CCAC), OPAB-03 (TGGCGCACAC), OPA-04 (AATCGGGCTG), dan OPA-10 (GTGATCGCAG). Volume final campuran reaksi PCR adalah 25 µl. Komposisi reaksi PCR sebagai berikut: 12,5 µl PCR Gotaq Green Master Mix 2x, 2,5 µl primer, 5 µl DNA sampel, dan 5 µl nucleus water dengan menggunakan mesin thermo cycler berlangsung dengan urutan sebagai berikut: Tahap 1: praamplifikasi PCR 1 menit pada suhu 94 °C; Tahap II: amplifikasi PCR dilakukan sebanyak 40 siklus reaksi, dengan pemisahan utas DNA genom (denaturasi) pada suhu 94 °C, 35 detik. Penempelan primer (annealing) pada suhu 40°C, 35 detik: sintesis pada suhu 72 °C, 1 menit; dan tahap III: Pasca-amplifikasi pada suhu 72 °C, 10 menit (Freed et al., 2014) .

Fragmen DNA hasil amplifikasi untuk setiap primer dipisahkan pada gel agarosa 1,5% dalam buffer TAE 1X pada 80 V selama 1 jam. Gel agarosa diwarnai dengan 2 µl ethidium bromida. Pita DNA hasil amplifikasi diamati di atas transiluminator UV dan dilanjutkan dengan pemotretan menggunakan alat dokumentasi gel UV. Profil pita RAPD diamati berdasarkan pola polimorfiknya, yaitu dengan melihat jumlah dan ukuran pita.

Hasil sekuens dengan primer ITS dimasukkan ke database bank gen NCBI untuk menentukan homologi dengan data yang ada di NCBI. Pohon filogenetik dibangun menggunakan perangkat lunak Mega 5.2.

Pita polimorfik masing-masing sampel DNA diamati untuk menentukan adanya perbedaan isolat. Setiap posisi pita DNA diubah ke dalam bentuk data biner dengan memberi nilai 1 jika ada pita dan 0 jika tidak ada pita. Data biner ini selanjutnya diolah dengan menggunakan program perangkat lunak Darwin 6.0.14. Berdasarkan nilai kesamaan genetik tersebut dilakukan analisis pengelompokan (cluster analysis) menggunakan metode Neighbour-Joining Tree. Hasil analisis pengelompokan tersebut berupa dendogram kesamaan genetik yang menunjukkan hubungan kesamaan antar isolat.

Hasil pengamatan morfologi secara makro- skopis dan mikroskopis menunjukkan cendawan yang diisolasi dari tanah pertanaman kelapa sawit adalah Metarhizium sp.Gambar 1. Secara makroskopis warna koloni cendawan berwarna kuning kehijauan, dengan atau tanpa zonasi. Secara mikroskopis konidia berbentuk silinder dan berwarna hijau.

Hasil amplifikasi DNA 15 sampel M. anisopliae menggunakan primer ITS 1 dan ITS 4 berada pada kisaran 600 pb. Hasil sekuensing disajikan padaTabel 2 filogenetik hasil sekuensing menggunakan primer ITS disajikan padaGambar 2. Dari 15 sampel yang disekuensing diperoleh kesamaan genetik dengan kisaran 86–99% dengan strain yang dirujuk yang terdaftar di website NCBI. Informasi strain rujukan untuk membandingkan 15 sampel M. anisopliae disajikan padaTabel 3. Dari hasil BLAST NCBITabel 3 15 isolat M. anisopliae pada penelitian ini berkerabat dekat dengan Metarhizium yang diisolasi dari tanah dari China, Australia, Turki, Jepang, British Columbia, Swiss, dan Amerika.

Hasil amplifikasi terhadap 10 primer menunjukkan bahwa hanya 8 primer yang dapat menghasilkan pita pada sampel M. anisopliae. Ukuran DNA hasil amplifikasi diestimasi melalui perbandingan migrasi setiap fragmen yang diamplifikasi dengan fragmen marka (DNA ladder 100 pb). Dari 8 primer yang produktif, total jumlah pita RAPD-PCR yang dihasilkan sebanyak 39 pita (lokus) dengan rataan jumlah pita per primer sebanyak 4,875 pita.

Jumlah pita terbanyak adalah 11 pita diamplifikasi oleh primer OPA-03, dan terendah adalah 2 pita yang diamplifikasi oleh primer OPAB-04, OPC-01, dan OPA-04. Profil pita-pita yang dihasilkan dari kedelapan primer yang telah diuji, dapat digunakan untuk tujuan analisis keragaman genetik M. anisopliae. Profil pita DNA M. anisopliae dengan marka RAPD dapat dilihat padGambar 3.

Berdasarkan hasil amplifikasi dengan menggunakan 8 primer, diperoleh data berupa skoring untuk menentukan kesamaan genetik antar individu dalam 15 sampel M. anisopliae.

Pengelompokan hasil analisis keragaman genetik melalui pohon filogenetik (dendogram) berdasarkan marka molekuler RAPD, dapat mengetahui kekerabatan M. anisopliae di 15 lokasi propinsi Sumatera Utara. Pohon filogenetik dapat dilihat padaGambar 4. Hasil analisis jarak genetik atau ketidaksamaan genetik M. anisopliae berdasarkan teknik RAPD disajikan padaTabel 4.

Identifikasi morfologi M. anisopliae diamati berdasarkan bentuk dan warna konidia, serta warna koloni. Bentuk konidia dalam media SDAY di bawah pengamatan mikroskop berbentuk silinder dengan ujung bulat dan umumnya berwarna hijau muda dan beruntai bersama. Lima belas isolat dari penelitian ini diidentifikasi sebagai M. anisopliae berdasarkan karakter morfologi. Ukuran konidia dengan lebar minimum dan maksimum masing- masing adalah 1,80 ± 0,29 μm dan 2,43 ± 0,29 μm, serta panjang minimum dan maksimum masing- masing adalah 5,96 ± 0,41 μm dan 6,54 ± 0,57 μm. Hal ini, sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh (Ghayedi & Abdollahi, 2013) bahwa konidia M. anisopliae berbentuk silinder ke oval dan berukuran <9 μm. Rasio panjang/lebar konidia minimum 2,63 μm dan maksimum 3,56 μm. (Tangthirasunun et al., 2010) membagi dimensi konidia rasio panjang/lebar konidia M. anisopliae ke dalam tiga kelompok. Kelompok rasio panjang/ lebar konidia yang rendah, yaitu berukuran ≤2,18 μm, kelompok rasio panjang/lebar konidia medium berukuran antara 2,33–2,87 μm, dan kelompok rasio panjang/lebar konidia tinggi berukuran ≥2,91 μm. Isolat M. anisopliae pada penelitian ini masuk ke dalam kategori konidia medium dan tinggi yang dikemukakan oleh (Tangthirasunun et al., 2010) .

Hasil pengamatan warna koloni isolat M. anisopliae yang ditumbuhkan pada media SDAY selama 16 hari menunjukkan miselia cendawan awalnya berwarna putih ke krem, lalu menjadi kekuningan atau kuning kehijauan atau menjadi hijau tua. Umumnya, isolat berwarna kuning kehijauan, kecuali M13 hijau tua. Hal ini, sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh (Ghayedi & Abdollahi, 2013) bahwa warna koloni M. anisopliae adalah hijau kekuningan dan warna hijau zaitun.(Bridge et al., 1993)mendeskripsikan M. anisopliae memiliki warna hijau kekuningan, warna kuning langsat, hijau tua rumput, merah jambu atau merah anggur kekuningan. (N et al., 2015) juga melaporkan morfologi warna koloni M. anisopliae adalah hijau pucat atau hijau tua.

Di alam isolat M. anisopliae mengandung kumpulan genotipe yang beragam dan mungkin terdiri atas spesies yang kompleks dan banyak melibatkan ekpresi genom. Oleh karena itu, bisa terjadi bahwa dalam satu taksa, isolat individu dapat menunjukkan variasi karakter biologi (Rachappa et al., 2009). (Milner et al., 2002) menemukan variasi dalam karakter koloni M. anisopliae yang dikumpulkan dari lokasi geografi dan inang serangga. (Fernandes et al., 2009) menyatakan morfologi M. anisopliae yang berbeda dapat terjadi karena kondisi lingkungan dan fisiologis yang bervariasi.

Dari pohon filogenetik hasil analisa sekuensing 15 sampel isolat M. anisoplie memiliki kekerabatan yang dekat dengan M. anisopliae dan M. brunnuem yang diisolasi dari tanah dari 15 lokasi. M1 (Kampung Baru) memiliki kekerabatan 86% dengan nomor aksesi KX057377 dan KX057377 (China) dan FJ177494 (Turki). M12 (Mancang) memiliki kekerabatan yang dekat, yaitu 98% dengan M. anisopliae dan M. brunnuem dengan nomor aksesi AF137059 (Australia), HQ331451 (Swiss), dan NR_132023 (Amerika). M9 (Lias Baru) memiliki kekerabatan yang dekat, yaitu 99% dengan M. anisopliae dengan nomor aksesi KX057378 (China), FJ177494 (Turki), dan FJ545279 (China). Sisa isolat lainnya memiliki kekerabatan yang dekat, yaitu 99% dengan M. anisopliae dengan nomor aksesi KX057377 (China) dan EU307909 (British Columbia). Dalam penelitian ini, semua sampel M. anisopliae diisolasi dari tanah perkebunan (pertanian). (Nishi et al., 2017) melaporkan lebih banyak menemukan M. anisopliae pada tanah pertanian dibandingkan dengan tanah bukan pertanian. Akan tetapi, (Keyser et al., 2015)melaporkan bahwa jarang menemukan M. anisopliae dari tanah pertanian di Denmark dan lebih didominasi oleh M. flavoviridae. Hal ini menunjukkan bahwa distribusi M. anisopliae menunjukkan variasi pada sampel tanah dan lokasi yang berbeda. (Dong et al., 2016) melaporkan bahwa pada cendawan Metarhizium melimpah di daerah Selatan Barat Daya daerah China termasuk daerah pertanian. Hal ini berhubungannya dengan kondisi iklim area yang memiliki waktu musim panas yang panjang dengan rata-rata suhu 27–33 °C dan dengan musim dingin yang pendek tanpa salju sehingga kondisi ini sesuai dengan pertumbuhan M. anisopliae. Diduga kondisi ini sama dengan di Sumatera Utara dengan rata-rata suhu 22,1–33 °C(Sumut, 2016) yang menyebabkan homologi cendawan M. anisopliae yang diperoleh dari penelitian ini berkisar 98% dengan cendawan M. anisopliae yang diisolasi oleh (Freed et al., 2014) . Hasil penelitian (Dong et al., 2016)menemukan spesies M. anisopliae di daerah Tibet, tetapi tidak di Qinghai dan Gansu (China) karena daerah geografi Tibet lebih hangat dibandingkan dengan di Qinghai dan Gansu.

Jumlah pita DNA hasil amplifikasi dari ke-8 primer dihasilkan 39 total pita DNA atau 98,44% pita di antaranya merupakan pita polimorfik. Semakin banyak pita polimorfik, semakin banyak situs penempelan primer (Trizelia, 2005) .

Primer yang paling banyak menghasilkan pita adalah primer OPAB-09, OPA-03, dan OPAB- 03 (7, 11, dan 7 pita). Hal ini sama dengan penelitian yang dilakukan oleh(Freed et al., 2014) bahwa 5 primer, yaitu OPA-04, OPA-03, OPA-10, OPAB-09, dan OPA-12) adalah yang paling edukatif karena primer-primer ini mengenali pita polimorfik secara maksimum dan menghasilkan jumlah pola pita yang tinggi dengan 49% pita adalah polimorfik.

Jarak genetik antara isolat dari berbagai lokasi disajikan pada . Jarak genetik antara isolat berkisar dari 0,051 sampai 0,520%, dengan jarak genetik maksimum 0,520% antara isolat Lanbau (Simalungun) dengan Kampung Baru (Labuhan Batu) dan isolat Bandar Tonga (Simalungun) dan Sipenggeng (Tapanuli Selatan). Jarak atau ketidaksamaan genetik ini diduga karena lokasi pengambilan isolat-isolat ini berada pada kabupaten yang berjauhanTabel 1. Sementara, jarak genetik terdekat isolatnya diambil dari kabupaten yang sama (berdekatan).

Pada pohon filogenetik berdasarkan hasil analisis RAPD, M. anisopliae terbagi menjadi 3 kelompok (cluster), yaitu kelompok 1 terdiri atas Ma 11 (Teluk), Ma 7 (Lanbau), Ma 4 (Sipenggeng), Ma 3 (Bandar Selamat), Ma 2 (Bandar Rejo), Ma 14 (Namotualang) dan Ma 13 (Gunung Rintih); kelompok 2 terdiri atas Ma 8 (Bandar Tonga), Ma 6 (Bandar Tarutung), Ma 15 (Kutambelin), Ma 1 (Kampung Baru), Ma 9 (Lias Baru), Ma 5 (Perdamean), dan Ma 10 (Perdamaian); dan kelompok 3 hanya terdiri atas Ma 12 (Mancang). Dari pengelompokan-pengelompokan yang terbagi pada pohon filogenetik, tidak ada kelompok yang berasal dari kabupaten yang sama dan semua kelompok tersebar dalam 3 kelompok. Isolat yang berasal dari tempat yang sama belum tentu memiliki profil genetik yang sama. Keadaan tanah kebun yang diambil meskipun berasal dari kabupaten yang sama, diduga memiliki perbedaan kondisi kebun yang berbeda. Perbedaan ini bisa disebabkan banyak hal, dapat disebabkan oleh kondisi internal cendawan itu sendiri atau dapat juga disebabkan oleh kondisi eksternal, yaitu interaksi cendawan dengan lingkungan. Menurut (Strom & Bushley, 2016) heterokariosis adalah bagian integral dari siklus paraseksual yang digunakan oleh cendawan aseksual (termasuk M. anisopliae) yang dominan untuk introduksi dan mempertahankan variasi genetik dalam populasi. Heterokariosis mungkin berperan dalam kemampuan jamur untuk merespons lingkungan mereka. Melalui proses ini akan menghasilkan strain yang secara genetik berbeda. (VN & J, 2007) menyatakan bahwa cendawan M. anisopliae juga mengembangkan adaptasi yang berbeda sesuai dengan jenis tanah dan/atau rizosfer yang ada di mana cendawan ini muncul.

Pada pohon filogenetik dapat dilihat pada kelompok-kelompok yang sama asal isolat tidak terdapat pengelompokan berdasarkan jarak geografis antara isolat. Hal ini sama seperti hasil penelitian (Sevim et al., 2012) bahwa variabilitas genetik yang tinggi ditemukan antara isolat M. anisopliae var. anisopliae yang diperoleh dari tanah pertanian/non pertanian wilayah timur Laut Mati Turki dan kelompok yang ditentukan tidak terkait dengan tipe habitat, lokasi geografis, pertumbuhan di tempat yang berbeda suhu, resistensi UV, atau virulensi terhadap T. molitor. (Pong et al., 2017) juga melaporkan M. anisopliae yang diisolasi dari tanah mineral dan tanah gambut tidak berada dalam satu kelompok, ini menunjukkan bahwa jenis tanah bukan faktor yang mempengaruhi variasi genetik M. anisopliae. Pada pohon filogenetik ada temuan menarik bahwa pertanaman yang diberi tandan kosong kelapa sawit (M8 dan M15) dan limbah cair kelapa sawit (M10) berada dalam cluster yang sama. Praktek budi daya ini diperoleh dari hasil wawancara petani yang kebunnya menjadi lokasi pengambilan sampel tanah untuk isolasi M. anisopliae.

Primer-primer RAPD yang digunakan dalam penelitian mampu mempelajari keragaman genetik M. anisopliae. Hal ini seperti yang dilakukan (Ranga & Saini, 2011) yang membuktikan bahwa Metarhizium yang berada dalam populasi tertentu memiliki tingkat polimorfisme yang bervariasi. (Freed et al., 2014) mengatakan RAPD-PCR dari M. anisopliae menunjukkan tingkat polimorfisme yang dapat dipertimbangkan dalam kelompok yang sama dan tidak ada hubungannya dengan asal serangga inang. Hasil penelitian (Velásquez et al., 2007) menunjukkan bahwa analisis RAPD-PCR berguna dalam mendeteksi variabilitas genetik di dalam dan di antara kelompok isolat M. anisoplie yang dikumpulkan dari wilayah geografis yang berbeda. Tidak ada genotipe identik yang terdeteksi oleh analisis ini. Namun, analisis RAPD tidak mendeteksi adanya hubungan antara keragaman genetik isolat dan lokasi asalnya isolat dikumpulkan.